Die Rolle der Acylierung von Gp5/M des Virus des porzinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms für den Zusammenbau und die Knospung von Viruspartikeln, aufgeklärt durch Fluoreszenzmikroskopie mit hoher Auflösung.

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Dr. Susann Kummer; Privatdozent Dr. Michael Veit
• Fachliche Zuordnung: Tiermedizin
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 525482931

Das porzine respiratorische und reproduktive Syndrom Virus (PRRSV) ist der wichtigste Erreger in Schweinebeständen, aber insbesondere seine Membranproteine und essentielle Aspekte der Virusvermehrung, wie das Virusbudding, sind kaum untersucht. In einem früheren DFG-Projekt konnten wir zeigen, dass Gp5/M, das am häufigsten vorkommende Membranprotein von PRRSV, an Cysteinen am Ende der Transmembranregion von Gp5 und M acyliert ist. Diese Modifikation ist für die Virusreplikation, insbesondere für den Zusammenbau von Viren, unerlässlich. Die Enzyme, die Gp5/M acylieren, sind bisher nicht identifiziert worden, aber die Proteinacylierung wird durch eines oder mehrere der 23 Mitglieder der DHHC-Proteinfamilie vermittelt. Zusätzlich haben wir das auf künstlicher Intelligenz basierende System Alphafold2 verwendet, um eine zuverlässige Struktur von Gp5/M vorherzusagen. Es ergab sechs gekrümmte und gekippte Transmembran-Helices, drei von jedem Protein. Die dritte Transmembran-Helix ragt in das Zytoplasma hinein und enthält die Acylierungsstellen, die sich auf der hydrophoben Seite einer amphiphilen Helix befinden. Diese ähnelt der amphiphilen Helix von M2 des Influenza A Virus, die in die Membran inseriert, um die Virusfreisetzung einzuleiten. Wir wollen die Hypothese testen, dass an Gp5 und M gebundene Fettsäuren für das Clustering von Gp5/M-Dimeren erforderlich sind. Mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie werden wir untersuchen, ob Gp5/M Oligomere an Golgi-Membranen bilden und ob diese Clusterbildung reduziert wird, wenn die Fettsäurebindungsstellen von Gp5 und/oder M entfernt werden. Um dieses Ziel zu erreichen, ist Susann Kummer, eine Spezialistin für STED-Mikroskopie, eine Mitantragstellerin. Mechanistisch betrachtet könnten die Fettsäuren Cholesterin an die virale Knospungsstelle rekrutieren, wie es für das acylierte Spikeprotein von SARS-CoV-2 beschrieben wurde. Diese Hypothese wird mit einem photoaktivierbarem Cholesterinderivat getestet, welches wir bereits zur Identifizierung einer Cholesterinbindungsstelle im HA von Influenza A Viren verwendet haben. Darüber hinaus werden wir die Rolle der amphiphilen Helices von Gp5 und M für die Virusreplikation und Acylierung untersuchen. Schließlich wollen wir die DHHC-Enzyme identifizieren, die Gp5 und M acylieren. Die wahrscheinlichsten Kandidaten sind DHHC 1, 4, 6 und 20, da sie die einzigen im endoplasmatischen Retikulum-ansässigen DHHCs sind und Gp5 und M acyliert werden, wenn sie allein exprimiert und nicht über das ER hinaus transportiert werden. Wir wenden dafür dieselben Methoden (siRNA und CRISPR/Cas9-vermittelter knock-out von DHHC-Genen) an, die wir kürzlich zur Identifizierung der DHHCs, die die Acylierung des HAs katalysieren, etabliert haben. Dieses Projekt liefert nicht nur molekulare Informationen für einen wichtigen Schritt im Replikationszyklus von Arteriviren, sondern zeigt auch Ähnlichkeiten und Unterschiede bei der Virusknospung an internen Membranen und an der Plasmamembran.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen