Faltung und Assemblierung von künstlich hergestellten superhelikalen Proteinen

• Antragsteller: Professor Dr. Johannes Stigler
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 527129816

Proteine, die aus Tandem-Wiederholungen kleiner Sequenzmotive bestehen (Repeatproteine), sind in der Natur allgegenwärtig und haben wichtige Anwendungen in der Bionanotechnologie. Neue KI-Methoden haben zu enormen Erfolgen beim De-novo-Design von Proteinstrukturen geführt, die aus ebendiesen Repeat-Proteinen aufgebaut sind, und die wie ihre natürlichen Gegenstücke in superhelikale Tertiärstrukturen falten. Diese Bausteine können so gestaltet werden, dass sie sich selbst zu größeren Komplexen zusammenfügen. Sie bieten vielseitige Anwendungen, beispielsweise im Bau molekularer Maschinen in der Nanotechnologie, oder als Gerüst für die Entwicklung von multivalenten Ligandenbindern in der Medizin. Während die Faltung von Proteinen im allgemeinen seit Jahrzehnten erforscht wird, fehlt es jedoch an experimentellen Daten darüber, ob unser derzeitiges Bild davon, wie natürliche Repeatproteine falten, auch auf den Bereich dieser neuartigen de-novo designten Proteine zutrifft. Da beispielsweise die meisten Design-Pipelines nur die thermodynamische Stabilität der gefalteten Struktur optimieren, nicht aber einen effizienten Faltungsweg, ist es möglich, dass der künstliche Designprozess Frustrationen in der Energielandschaft der Faltung verursacht, die zu einer ineffizienten (d. h. langsamen) Faltung sowie zu mechanisch starren Strukturen führen können. Während die Mechanik einiger natürlich vorkommender Wiederholungsproteine bereits untersucht wurde, gibt es nur wenige Informationen über die Mechanik von de-novo entworfenen Wiederholungsproteinen. Um diese Wissenslücke zu schließen, schlage ich vor, die Faltung und den Zusammenbau künstlich konstruierter Solenoid-Repeat-Proteine mit mechanischen Entfaltungsexperimenten mittels optischer Pinzetten auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. In Vorarbeiten konnten wir in Einzelmolekülexperimenten zeigen, dass solch frustrierte Faltung in einem de-novo entworfenen Nicht-Tandem-Repeat-Protein existiert. Ebenso konnten wir den detaillierten Faltungsweg von langen CTPR Repeat-Proteinen mit der Auflösung einzelner Helices aufschlüsseln. Die geplanten Experimente sollen diese Studien auf de-novo designte Wiederholungsproteine ausweiten. Hierbei ist das Ziel, die Faltung und die Assemblierung dieser Strukturen mit einer maximalen Auflösung von Viertelhelices bei einer Bandbreite von 10 kHz zu beobachten und gleichzeitig Informationen über die Mechanik der gefalteten Strukturen zu liefern. Im Rahmen des Arbeitsprogramms soll untersucht werden, ob sich durch künstliches Design gewonnene Repeatproteine anders falten und assemblieren als ihre natürlichen Pendants. Darüber hinaus soll untersucht werden, ob Modifikationen von Sequenz und Form zu einer veränderten Flexibilität des gefalteten Proteingerüsts führen. Diese Daten werden für das zukünftige Design dynamischer Proteinstrukturen in der Biomedizin und Nanotechnologie von Bedeutung sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen