Fluoreszenz-Imagingsystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Gegenstand der laufenden Projekte des Instituts für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie ist die Erfassung des zeitlichen Verlaufs und der räumlichen Ausbreitung intrazellulärer Signale in Echtzeit. Im Mittelpunkt der Projekte stehen Untersuchungen zu Struktur, Aktivierungsmechanismen und Funktion der spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle und der TRP-Kanäle. Mit Hilfe des Fluoreszenz-Imagingsystems ist es uns gelungen, die Funktion der TRPV6-Kanäle im männlichen Reproduktionssystem aufzuklären. Aus früheren Studien war bekannt, dass TRPV6-Kanäle fast ausschließlich Ca2+-Ionen leiten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass TRPV6-Kanäle die Ca2+-Resorption aus dem Samenkanal regulieren und somit zur Erhaltung eines normalen Ca2+-Spiegels im Samenkanal entscheidend beitragen, was wiederum für die normale Entwicklung der Spermien notwendig ist. So führen Mutationen, welche TRPV6-Kanäle inaktivieren, zu einem erhöhten Ca2+-Spiegel im Samenkanal und zu männlicher Infertilität in Mausmodellen. Anders als TRPV6-Kanäle leiten TRPC5-Kanäle sowohl Ca2+-Ionen wie auch Na+- und K+-Ionen und deshalb wurde vermutet, dass TRPC5-Kanäle das Membranpotential der Zelle regulieren. Wir konnten zeigen, dass TRPC5-Kanäle als Bindeglied zwischen einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und der darauf folgenden Depolarisation der Zelle fungieren. Mit Hilfe des Fluoreszenz-Imagingsystems haben wir für dieses Projekt eine Messmethode etabliert, welche die gleichzeitige Bestimmung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit FURA-2 und die Änderungen des Membranpotentials mit einem spannungsabhängigen Farbstoff ermöglicht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Ca2+-Nanodomains, die sich nach Aktivierung von CRAC (Calcium-Release-Activated-Calcium) -Kanälen und von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen bilden, ausreichen, um nah gelegene TRPC5-Kanäle zu aktivieren, was wiederum zu Depolarisation der Zelle führt. TRP-Kanäle sind nicht nur in Säugetieren identifiziert worden, sondern auch in Chlamydomonas und in der Hefe. In einer weiteren Arbeit untersuchten wir die Funktion von weit entfernten Homologen der TRP- Kanäle, nämlich dieYvc1-Kanäle der Hefe. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Yvc1-Kanäle sich in der Membran der Hefe-Vakuole befinden und dort als mechanisch gesteuerte Ca2+-Ausstromkanäle fungieren. In allen Zellen strömen ständig Ca2+-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) aus und werden gleichzeitig durch SERCA zurückgepumpt. So werden der Ca2+-Füllungszustand des ER reguliert und die cytosolische Ca2+-Signaltransduktion ermöglicht. Indirekte Hinweise deuteten darauf hin, dass neben Presiniline und Bcl-2 auch der ubiquitäre Sec61-Komplex (auch Translocon genannt) zum Ca2+-Ausstrom aus dem ER beiträgt. In Zusammenarbeit mit R. Zimmermann konnten wir zeigen, dass die Inaktivierung des SEC61A1-Gens mittels RNAi in HeLa-Zellen mit einer Reduktion des Ca2+-Ausstroms aus dem ER einhergeht und konnten somit den ersten direkten Hinweis auf den Sec61-Komplex als Ca2+-Ausstromkanal liefern. Darüber hinaus haben wir in dem Sec61-Komplex eine Bindungsstelle für Calmodulin identifiziert und funktionell charakterisiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von Ca2+-Calmodulin an den Sec61-Komplex den Ca2+-Ausstrom aus dem ER unterdrücken kann, ohne dabei den Proteintransport zu behindern. Das Gen-Inaktivierungs-Protokoll sowie das Ca2+-Imaging-Protokoll mit Anwendung des Fluoreszenz-Imagingsystems wurden in Form eines Videos in Journal of Visualized Experiments zugänglich gemacht. Im Rahmen unserer Arbeiten mit dem Fluoreszenz-Imagingsystem haben wir die Eigenschaften eines spannungsabhängigen Farbstoffs (FMP) in Zelllinien sowie in isolierten Neuronen charakterisiert. Nach unseren Ergebnissen ist FMP bestens geeignet zur gleichzeitigen Bestimmung des Membranpotentials und der intrazellulären Ca2+- oder Na+-Konzentration mit FURA-2 oder SFBI. FMP erlaubt auch die Analyse der Wirkung verschiedener Neurotransmitter wie Glutamat, Acetylcholin und GABA sowie das Imaging der elektrischen Aktivität in neuronalen Netzwerken.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+- selective ion channels. J Biol Chem. 284(49):34423-32, 2009
Gross SA, Guzmán GA, Wissenbach U, Philipp SE, Zhu MX, Bruns D, Cavalié A
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Properties of the intracellular transient receptor potential (TRP) channel in yeast, Yvc1. FEBS Lett. 584(10):2028-32, 2010
Chang Y, Schlenstedt G, Flockerzi V, Beck A
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Interaction of calmodulin with Sec61α limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. EMBO J. 30(1):17-31, 2011
Erdmann F, Schäuble N, Lang S, Jung M, Honigmann A, Ahmad M, Dudek J, Benedix J, Harsman A, Kopp A, Helms V, Cavalié A, Wagner R, Zimmermann R
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Male fertility depends on Ca2+ absorption by TRPV6 in epididymal epithelia. Sci Signal. 4(171):ra27, 2011
Weissgerber P, Kriebs U, Tsvilovskyy V, Olausson J, Kretz O, Stoerger C, Vennekens R, Wissenbach U, Middendorff R, Flockerzi V, Freichel M
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Moderate calcium channel dysfunction in adult mice with inducible cardiomyocyte-specific excision of the cacnb2 gene. J Biol Chem. 286(18):15875-82, 2011
Meissner M, Weissgerber P, Londoño JE, Prenen J, Link S, Ruppenthal S, Molkentin JD, Lipp P, Nilius B, Freichel M, Flockerzi V
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Sec61 complexes form ubiquitous ER Ca2+-leak channels. Channels (Austin). Epub ahead of print, 01 May 2011
Lang S, Erdmann F, Jung M, Wagner R, Cavalie A, Zimmermann R
