Chemisch-proteomische Untersuchung von äußeren Membranvesikeln zur Bestimmung ihrer Funktion in mikrobiellen Interaktionen

• Antragsteller: Dr. Markus Lakemeyer
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 528114058

Die menschliche Darmflora ist ein komplexes und dynamisches mikrobielles Ökosystem. Ein Ungleichgewicht der Mikrobiota, bekannt als Dysbiose, wird mit einer Reihe von gastrointestinalen Erkrankungen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen und Darmkrebs, in Verbindung gebracht. Hierbei scheint eine übermäßige Proteolyse, entweder durch menschliche oder bakterielle Proteasen, wesentlich zur Pathogenese beizutragen. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch weitgehend unklar. Bakterien der Ordnung Bacteroidales produzieren große Mengen an äußeren Membranvesikeln (OMVs), kleinen kugelförmigen Kompartimenten, die sich von der äußeren Membran gramnegativer Bakterien ableiten. OMVs können ihre biologische Fracht entweder membrangebunden oder eingekapselt im Inneren der Vesikel über weite Strecken transportieren und spielen somit eine wichtige Rolle für Interaktionen zwischen verschiedenen Mikroben sowie zwischen Bakterien und dem menschlichen Wirt. Erste Studien legen nahe, dass Bacteroidales OMVs zu großen Teilen aus Lipoproteinen, insbesondere Proteasen, bestehen, die an der äußeren Oberfläche verankert sind und somit direkt mit ihrer Umgebung interagieren können. Daher sind Proteasen aus Bacteroidales potentiell wichtige Mediatoren von mikrobiellen Interaktionen. Bisher ist jedoch kaum bekannt, welche Proteine in den OMVs einzelner Bacteroidales Stämme transportiert werden und wie externe Faktoren die Zusammensetzung sowie die Lokalisation von Proteinen in OMVs modulieren. Ebenfalls ist unklar, wie bakterielle Proteasen die Zusammensetzung der Darmflora beeinflussen und damit zur Pathogenese beitragen. In diesem Projekt werden wir chemisch-proteomische Methoden entwickeln, um Bacteroidales OMVs und ihre biologische Funktion umfassend zu charakterisieren. Zunächst werden wir Stämme und Bedingungen identifizieren, die zu maximaler OMV-Sekretion führen. Anschließend werden wir proteomische Methoden anwenden, um die Proteome verschiedener OMVs zu charakterisieren, wobei der Fokus auf dem Lipidierungszustand von Lipoproteinen liegt. Ausgewählte Proteasen, die in OMVs gefunden werden, werden rekombinant exprimiert und biochemisch charakterisiert. Außerdem werden wir fluorogene Substrate, kovalente Inhibitoren und chemische Sonden für einzelne Proteasen entwickeln. Mit Hilfe dieser Verbindungen werden wir aufklären, wie OMVs und ihre zugehörigen Proteasen einzelne bakterielle Stämme sowie bakterielle Co-Kulturen beeinflussen. Schlussendlich werden wir fluoreszierende kovalente Sonden einsetzen um die dynamische Entstehung und den Transport von OMVs mittels Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen. Zusammengefasst wird dieses Projekt zu einem detaillierten Verständnis extrazellulärer bakterieller Proteine führen und außerdem maßgeschneiderte Werkzeuge hervorbringen, welche es ermöglichen, die Rolle von OMVs in mikrobiellen Interaktionen zu analysieren.

• DFG-Verfahren: Emmy Noether-Nachwuchsgruppen
• Großgeräte: Anaerobic Chamber for bacterial cultivation ; Multipurpose refrigerated (ultra)centrifuge
• Gerätegruppe: 1200 Laborzentrifugen (bis 25.000 1/Min)