Modulation von Ubiquitin-Genen zur Verbesserung der Prime Editing Effizienz.

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Dr.-Ing. Koraljka Husnjak, Ph.D.; Professor Dr. Manuel Kaulich, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 529014374

Nach mehr als einem Jahrzehnt CRISPR-basierter funktioneller Genomik in menschlichen Zellen bleibt unser Verständnis und die Überprüfung von Genvarianten in ihrem endogenen Kontext eine große Herausforderung. Dies ist größtenteils auf technologische Einschränkungen, statistische Ergebnisse von Gen-Editierungen und den Mangel an unvoreingenommenen phänotypischen Readouts zurückzuführen. Während jüngste Arbeiten das Prime Editing zur Erzeugung gewünschter Punktmutationen in menschlichen Zellen etabliert haben, ist die Erzeugung vieler paralleler Mutationen, die eine unvoreingenommene Prüfung von Genvarianten in großem Maßstab ermöglichen, bisher nicht realisierbar. Dies liegt vor allem an (i) der großen Zahl möglicher Genvarianten und (ii) den Beschränkungen, die den Prime-Editing-Techniken eigen sind. Unter Nutzung unserer technologischen und computergestützten Expertise schlagen wir hier vor, experimentelle Ansätze zu entwickeln, die Effizienz des Prime Editing zu verbessern und unvoreingenommene Genvarianten-Tests zu etablieren. All dies, sowie die Implementierung rechnergestützter Algorithmen zur Prime-Editing-Screening-Analyse, stützt sich auf wichtige Expertisen in unseren Labors. Wir werden Prime-Editing-Phänotypen für biologische Entdeckungen auf mehreren Ebenen nutzen. Erstens wird die Nutzung von Ubiquitin-Systemgenen (USGs) in ihrer regulatorischen Rolle für die Prime-Editing-Effizienz Aufschluss über biologischen Mechanismen geben, die Prime-Editing in menschlichen Zellen ermöglichen. Darüber hinaus werden sie Aufschluss über die regulatorische Rolle der USGs bei der Reparatur von DNA-Mismatches geben und bei der unvoreingenommenen Überprüfung von Genvarianten eingesetzt werden. Zweitens werden wir USP1-Prime-Editing-Varianten testen, um eine umfassende USP1-Mutationslandschaft zu erstellen, aus der wir funktionelle Aminosäuren extrahieren werden. Die Mutationslandschaft wird mit Strukturvorhersagen gepaart, um funktionsrelevante Domänen mit Aminosäureauflösung aufzuklären. Drittens wird die Kopplung von USP1-Variantentests mit verfügbaren USP1-Inhibitoren (iUSP1) dringend benötigte Erkenntnisse über mögliche iUSP1-Resistenz verursachende Mutationen liefern und die erste Resistenzlandschaft generieren, die durch Gen-Variantentests in menschlichen Zellen erzeugt wurde. Schließlich werden die hier entwickelten Techniken und Methoden auf breiterer Ebene als Blaupausen für die Erstellung genspezifischer Mutations- und Resistenzlandschaften in menschlichen Zellen fungieren. Das von uns vorgeschlagene Projekt ist die erste gemeinsame experimentelle Anstrengung, bei der CRISPR- und Prime-Editing-Screens mit unvoreingenommenen Genvariationstests in menschlichen Zellen kombiniert werden. Es verspricht innovative Ansätze und vielfältige biologische Einblicke in die Regulierung des Prime Editing und der DNA-Reparatur durch Gene des Ubiquitin-Systems zu liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen