Entschlüsselung der molekularen Mechanismen des Austritts von Orientia tsutsugamushi aus der Wirtszelle

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Christian Keller
• Fachliche Zuordnung: Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten ; Medizinische Mikrobiologie und Mykologie, Hygiene, Molekulare Infektionsbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 531703706

Intrazelluläre Krankheitserreger haben unterschiedliche Strategien entwickelt, um ihre Wirtszelle zu verlassen. Das derzeitige Wissen über die molekularen Details der Exit-Ereignisse intrazellulärer Bakterien stammt v.a. von prototypischen Erregern wie Salmonella, Shigella, Listeria oder Mycobacterium spp. Es gibt jedoch eine Fülle bakterieller Nicht-Modellorganismen, die aufgrund eines grundlegend anderen biologischen Lebenszyklus andere Strategien beim Exit anwenden. Ein Beispiel ist das obligat intrazelluläre humanpathogene Bakterium Orientia tsutsugamushi (Ot): Ot verlässt die Wirtszelle über cholesterinreiche Lipid Rafts in der Plasmamembran als einzelnes Bakterium, das von der Plasmamembran umhüllt wird. An der Plasmamembran der Wirtszelle bildet sich ein kleiner Stiel, der sich letztlich verschließt und so die Freisetzung des umhüllten Bakteriums ermöglicht. Dieser Austrittsmechanismus, der der Knospung (Budding) umhüllter Viren ähnelt, ist einzigartig unter den intrazellulären Bakterien. Die molekularen Einzelheiten sind jedoch noch nicht geklärt. In dem vorgeschlagenen Projekt beabsichtigen wir, in Zusammenarbeit mit den SPP2225-Plattformen 1 und 2 und unter Einsatz von Omics-Ansätzen sowie Super-Resolution- (SRM) und High-End-Elektronenmikroskopie, die Ultrastruktur des Knospungsprozesses von Ot aufzuklären. Zunächst werden Protein-Interaktome von bakteriellen Oberflächenproteinen durch Proximity-Ligationsassays gewonnen, unter Nutzung von Biotin-Ligase-Fusionsproteinen (BioID2). Bei der Auswahl für die detaillierte Charakterisierung der interagierenden Proteine werden wir uns auf Kandidaten aus der ESCRT-Maschinerie und ESCRT-Adapterproteine sowie auf Zytoskelettproteine konzentrieren. Die Interaktion dieser Proteine wird durch klassische Immunoassays bestätigt. In Zusammenarbeit mit der SPP2225 Imaging-Plattform 2 werden wir die interagierenden Wirtsproteine lokalisieren und SRM und korrelative 3D-Lichtelektronenmikroskopie einsetzen, um detaillierte topografische Informationen über die Ultrastruktur knospender Bakterien zu erhalten. Darüber hinaus werden wir die funktionelle Rolle der neu identifizierten Wirtszellproteine beim bakteriellen Budding analysieren. Zu diesem Zweck wollen wir u.a. Zelllinien entwickeln, die eine induzierbare Expression der mutierten Proteine nach Zugabe spezifischer Liganden ermöglichen. In einem ergänzenden Ansatz, der davon ausgeht, dass der Knospungsprozess nicht nur durch Proteine reguliert wird, werden wir uns mit der Beteiligung zellulärer, nicht-kodierender RNAs an der Interaktion mit Ot-Oberflächenproteinen und am Knospungsprozess befassen. Durch die Zusammenarbeit mit anderen Gruppen innerhalb des SPP 2225, die den Knospungsprozess von Plasmodium-Merosomen oder den Exit von Salmonella erforschen, wollen wir Orientia-spezifische und konservierte Merkmale des Exits definieren und so die unterschiedlichen und gemeinsamen Strategien beim Austritt intrazellulärer Krankheitserreger aufklären.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2225: Wirtszellaustritt intrazellulärer Pathogene