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Projekt
Identifizierung und Charakterisierung von Leseproteinen serin- und threoninverknüpfter Ubiquitinketten unter Verwendung nicht-hydrolysierbarer Diubiquitine und chemischer Proteomik
Antragsteller
Tim Aguirre
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Förderung
Förderung seit 2023
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 532187979
Die Ubiquitinierung ist eine vielseitige posttranslationale Modifikation, die an diversen zellulären Prozessen wie dem Proteinabbau, der epigenetischen Regulation und der DNA-Schadensreaktion beteiligt ist. In der Ubiquitin-Forschung ist es etabliert, dass die Ubiquitinierung durch die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminus des Ubiquitins und der Lysin-Seitenkette eines anderen Ubiquitins oder des Proteinsubstrats erfolgt. Vor kurzem wurde jedoch gezeigt, dass Ubiquitin auch an Serin- und Threonin-Seitenketten angebracht werden kann. Interessanterweise können diese Bindungen auch zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ub-Molekülen in Ubiquitinketten an den Resten Thr12, Thr14, Ser20 und Thr22 auftreten. Diese Enthüllung erhöht die ohnehin schon überwältigende Komplexität des "Ubiquitin-Codes" und verlangt die Identifizierung zellulärer Bindungspartner von Oxyester-verknüpften Ubiquitin-Ketten, um deren biologische Bedeutung zu verstehen. Das Hauptziel des vorgeschlagenen Projekts besteht darin, unter Verwendung von synthetischen Diubiquitinen, Bindepartner und Deubiquitinasen (DUBs) von serin- und threoninverknüpften Ubiquitin-Ketten durch Pulldown-Experimente zu identifizieren. Anschließend werden die mutmaßlichen Interaktionspartner gründlich in vitro charakterisiert. Zu diesem Zweck werde ich eine Methode zur Synthese nicht-hydrolysierbarer Diubiquitin-Proben entwickeln, welche an Thr12, Thr14, Ser20 und Thr22 verknüpft sind, wobei ich die Festphasen-Peptidsynthese und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloadditionen verwenden werde. Darüber hinaus werde ich einen Weg finden, um an die entsprechenden aktivitätsbasierten Proben zu gelangen, die eine elektrophile Gruppe an der Verknüpfungsstelle tragen, um Ligasen und DUBs kovalent zu binden. Beide Sorten von Proben werden anschließend in Pulldown-Experimenten verwendet, um Interaktionspartner von serin- und threoninverknüpften Ubiquitin-Ketten zu identifizieren. Die so erhaltene Liste angereicherter Proteine wird im Hinblick auf den Anreicherungswert und die potenzielle Gruppierung bestimmter Proteinfamilien oder -klassen und Bindungsdomänen sorgfältig analysiert. Eine Gen-Ontologie-Analyse kann wertvolle Einblicke in die zellulären Prozesse liefern, die von Oxyester-gebundene Ubiquitinketten reguliert werden. Ausgewählte mutmaßliche Bindungspartner werden rekombinant exprimiert und einer detaillierten biochemischen und biophysikalischen Analyse in vitro unterzogen. Darüber hinaus werden mir Kristallisationsversuche oder Cryo-EM-Analysen ermöglichen, Einblicke in spezifische Bindungsinteraktionen auf molekularer Ebene zu gewinnen. Letztendlich werde ich, je nachdem in welchem zellulären Stoffwechselweg die identifizierten Interaktoren oder DUBs eine Rolle spielen, bestimmte Zellstressfaktoren wie Hunger, DNA-Schäden, Oxidation oder Proteasom-Inhibition auslösen und die Veränderungen in der Interaktion zwischen den Diubiquitin-Proben und dem untersuchten Protein in cellula beobachten.
DFG-Verfahren
WBP Stipendium
Internationaler Bezug
Niederlande
