Tierexperimentelle Untersuchungen zur Effizienz eines Hyperthermie-induzierbaren Vektors für die nicht-virale Gentherapie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zusammenfassend lässt sich aus dem Projekt ableiten, dass der venwendete wildtyp-mdr1 Promotor sowohl in vitro, als auch in vivo Hyperthermie-induzierbar ist und vor allem für eine Hyperthermie-induzierte Transgenexpression (z.B. für TNF-a) im Rahmen einer Tumor-Gentherapie geeignet ist. Unsere diesbezüglichen in vivo Experimente haben gezeigt, dass mit Hilfe der Kombination von Hyperthermie-induzierter TNF-a Expression und Zytostatikabehandlung eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums zu erzielen ist. Eine Optimierung des mdr1-Promotors durch die gezielte zweifache oder vierfache Multimerisierung der Y-Box Sequenzen hatte jedoch nicht die erhoffte Steigerung der Hyperthermie-Induzierbarkeit erbracht. Die entsprechenden in vitro Experimente zeigten keine Erhöhung der Transgenexpressionen in den 2-fach oder 4-fach Y-Box Promotorvarianten im Vergleich zum wildtyp-mdr1 Promotor. Daher muss geschlussfolgert werden, dass zumindest für diesen Promotor die Y-Box vermittelte Induktion keinen wesentlichen Faktor darstellt, wie unsprünglich angenommen. Daher sollten sich mögliche zukünftige Modifikationen eher auf die Optimierung der Hitzeschock-Elemente dieses Promotors fokussieren. Als eine neue Erkenntnis jedoch ging aus dem Projekt die Hyperthermie-Induzierbarkeit des viralen Immediate Eariy (IE) CMV-Promotors hervor. Hier zeigte sich eine starke Aktivität des Promotors sowohl in vitro, als auch in vivo. Als Mechanismus dieser Induktion könnte die Y-Box/YB-1 vermittelte Transkription verantwortlich sein, wie wir in unseren in vitro Expressions-Untersuchungen und EMSA Bindungsstudien gezeigt haben. Daher ist dieser Promotor als Kontrollsystem in derartigen Untersuchungen als eher kritisch zu bewerten. Vor allem aber hat der CMV-Promotor ein wertvolles Potential, um ebenfalls als Hyperthermieinduzierbares System zu fungieren. Dies könnte in weiteren, vor allem in vivo Untersuchungen näher geprüft werden. Im Rahmen des Projektes ist auch der Einsatz eines alternativen Vektorsystems für die Konstruktion eines Hyperthermie-induzierbaren Vektors geprüft worden, um bisherige Plasmid-basierte Vektoren abzulösen. Hierbei wurde im Besonderen auf die Verwendung des minimalistischen MIDGE-Systems fokussiert, das weniger immunogen und wesentlich kleiner, als Plasmidvektoren ist. In Kooperation mit der MOLOGEN AG konnten unsere vergleichenden Reportergen-Analysen zeigen, dass das MIDGE-Vektorsystem signifikant effizienter für eine Transgenexpression in Tumorzellen ist. Daher wird bei einer Weiterentwicklung eines Hyperthermie-induzierbaren Systems auf den Einsatz der MIDGE-Technologie gesetzt. Derzeit sind bereits entsprechende in vitro und in vivo Untersuchungen zu einer MIDGE-basierten Transgenexpression für die Tumorgentherapte in Bearbeitung. Neben der Optimierung des Hyperthermie-induzierbaren Vektorsystems war auch die Testung eines geeigneten Applikationssystems Bestandteil des Projektes. Im Rahmen dieser Arbeiten konnten wir zeigen, dass die in vivo Jet-Injektion für die intratumorale Applikation nackter DNA sehr geeignet ist. Dies wurde durch unsere Anwendung der Jet-Injektion für den in vivo Gentransfer eines Hyperthermie-induzierbaren Vektors zur Behandlung von xenotransplantierten Kolontumoren bestätigt. Besonders wichtig waren darüber hinaus unsere klinischen Untersuchungen zur Anwendung der Jet-Injektion. Hierbei konnten wir die Sicherheit und die Transfereffizienz dieser Technologie am Patienten zeigen. Diese Ergebnisse haben demonstriert, dass ein klinischer Einsatz der nicht-viralen Jet-Injektion auch im Rahmen einer Hyperthermie-kontrollierten Gentherapie möglich ist. Generell haben also unsere in vitro und vor allem in vivo Arbeiten gezeigt, dass ein Hyperthermie-induzierbares Vektorsystem ein wertvolles Mittel in einem multimodalen Konzept der konditioneilen Gentherapie von Tumoren darstellt. Ein möglicher klinischer Einsatz dieses gentherapeutisehen Ansatzes wird durch unsere Gruppe daher kritisch geprüft.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Use of the human mdr1 promoter for heat-inducible expression of therapeutic genes. Int. J. Cancer 98: 291-296, 2002
Walther W, Stein U, Schlag PM
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In vitro and in vivo characterization of a hyperthermia-inducible vector system for tumor gene therapy. Deutscher Krebskongress, Berlin, Germany, 27.2.-1.3.2004; J. Cancer Res. Clin. Oncol. 130, Suppl.l: 158, P0727, 2004
Arlt F, Walther W, Stein U, Schlag PM
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In vivo application of heat-induced gene therapy for tumor treatment. 95. Meeting der „American Association for Cancer Research" Orlando, FL, USA, 27.-31.3.2004; Proc. Am. Ass. Cancer Res. 45, 3780 2004
Walther W, Arlt F, Stein U, Fichtner I, Lemm M, Schlag PM
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Low-volume jet-injection for efficient in vivo gene transfer. Mol. Biotechnol. 28: 121-128, 2004
Walther W, Stein U, Fichtner I, Schlag PM
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Heat-regulated gene therapy for tumor treatment. 22nd Annual ESHO-Meeting; Graz, Austria. 08-11.06.2005
Walther W, Arlt F, Stein U, Fichtner I, Schlag PM
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Heat-regulated gene therapy for tumor treatment. XXVII ICHS Congress; Florence, Italy, 27.-28.10.2005
Walther W
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Quantitative and qualitative analysis of in vivo biodistribution of naked plasmid-DNA after nonviral intratumoral jet-injection. 96. Meeting der „American Association for Cancer Research" Anaheim, CA, USA, 16.-20.4. 2005; Proc. Am. Ass. Cancer Res.46: 3340, 2005
Walther W, Minow T, Stein U, Fichtner I, Schlag PM
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Use of the nuclease inhibitor aurintricarboxylic acid (ATA) for improved non-viral intratumoral in vivo gene transfer by jet-injection. J. Gene Med. 7: 477-485, 2005
Walther W, Stein U, Siegel R, Fichtner I, Schlag PM
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Nonviral jet-injection technology for efficient in vivo cancer gene therapy. ESGT Annual Meeting. Athens, Greece, 09.-12.11.2006
Walther W, Stein U, Kobelt D, Siegel R, Schlag PM
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Uptake, biodistribution and time course of naked plasmid-DNA trafficking after intratumoral in vivo jet-injection. Hum. Gene Ther 17: 611-624, 2006
Walther W, Stein U, Minow T, Martin R, Fichtner I, Schlag PM
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Use of nonviral in vivo jet-injection for hyperthermia-induced gene therapy. 97. Meeting der „American Association for Cancer Research". Washington. DC. USA. 1.-5.4. 2006; Proc. Am. Ass. Cancer Res. 47: 2090, 2006
Walther W, Arlt F, Aumann J, Stein U, Schlag PM
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Early results of a phase-l-clinical trial of nonviral gene ransfer by jet-injection into cutaneous lesions of metastatic breast cancer and in-transit lesions of metastatic melanoma. Chirurg. Forum. 36: 441-443, 2007
Siegel R, Stein U, Kobelt D, Aumann J, Schlag PM, Walther W
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Heat inducibility of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter: identification of possible mechanism. 18. European Student's Conference, Berlin, 07.-11. 10. 2007; Eur J. Med. Res. 12. Suppl. IV: 21, 2007
Kobelt D, Aumann J, Bölling O, Fichtner I, Lemm M, Stein U, Schlag PM, Walther W
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Heat-inducible in vivo gene gherapy of colon carcinoma by human mdr1 promoter regulated TNF-a expression. Mol. Cancer Ther. 6: 235-243, 2007
Walther W, Arlt F, Stein U, Fichtner I, Schlag PM
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Phase I trial of nonviral jet-injection gene transfer in in transit metastases from melanoma and skin metastases from breast cancer. 15. ESGCT-Meeting. Rotterdam Netheriands. 27.-31. 10. 2007; Hum. Gene Ther. 18: 994, P1 , 2007
Walther W, Siegel R, Kobelt D, Aumann J, Stein U, Schlag PM
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Nonviral jet-injection gene transfer in patients with in-transit metastases from melanoma and cutaneous metastases from breast cancer: results of a phase I clinical trial. 99. Meeting der .American Association for Cancer Research" San Diego, CA, USA, 12.-16. 4. 2008; Proc. Am. Ass. Cancer Res. 49: 1396, 2008
Walther W, Siegel R, Kobelt D, Aumann J, Stein U, Schlag PM
