Charakterisierung der Interaktion zwischen Transmembran-Agrin und den AMPA Rezeptor-assoziierten Proteinen Shisa6 und Shisa9 an Synapsen des Zentralen Nervensystems

• Antragsteller: Professor Dr. Stephan Kröger
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen ; Entwicklungsneurobiologie ; Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 533473678

Agrin und sein Rezeptorkomplex sind die Schlüsselregulatoren während der Bildung, Aufrechterhaltung und Regeneration der Neuromuskulären Endplatte. Die Transmembranform von Agrin (TM-Agrin) ist auch an Synapsen im ZNS konzentriert, aber seine Funktion im sich entwickelnden und adulten ZNS ist immer noch unklar. Wir haben kürzlich potenzielle Interaktionspartner von TM-Agrin an ZNS Synapsen untersucht indem wir Agrin aus Extrakten des Mauskortex immunpräzipitiert haben und das Präzipitat mittels Massenspektroskopie analysiert haben. In diesem Ansatz haben wir die AMPA Rezeptor-assoziierten Proteine Shisa6 und Shisa 9 (aber nicht Shisa7) als Bindepartner identifiziert. Die direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen konnte durch Präzipitation aus Extrakten von transfizierten 293HEK Zellen und aus Kortexextrakten mittels Antikörper sowohl gegen Shisa als auch gegen TM-Agrin bestätigt werden. Eine weitere unabhängige Bestätigung der Interaktion wurde mittels des „Proximity Ligation Assays“ erhalten. In dem vorliegenden Antrag soll zum einen die Interaktion von TM-agrin und Shisa Proteinen detaillierter charakterisiert werden und zum anderen mögliche Funktionen dieser Interaktion untersucht werden. So soll der „Bimolecular Fluorescence Complementation Assay“ als weitere unabhängige Methode benutzt werden, die direkte Interaktion zwischen TM-Agrin und den Shisa Proteinen zu bestätigen. Mit Hilfe von Deletionen und Punktmutationen sollen die Domänen bzw. die einzelnen Aminosäuren in TM-Agrin und in beiden Shisa Proteinen identifiziert werden, die für die Interaktion verantwortlich sind. Weiterhin werden wir versuchen, beide Proteine mit AMPA Rezeptoren an ZNS Synapsen in vivo zu colokalisieren und untersuchen, ob eine Überexpression von TM-Agrin die Dichte der Shisa- und der AMPA Rezeptor-enthaltenden Synapsen im Kortex in vivo verändert. Ähnlich soll untersucht werden, ob sich die Verteilung von TM-Agrin in Shisa6 –defizienten Tieren ändert. Mögliche Veränderungen in der Expression von Shisa Proteinen in TM-Agrin überexprimierenden Tieren und von TM-Agrin in Shisa6-defizienten Tieren sollten mit Hilfe von qPCR untersucht werden, um einen Einfluß auf die Transkription zu verifizieren. Als ersten Hinweis auf eine mögliche Funktion der TM-agrin Shisa Interaktion soll untersucht werden, ob die Expression von TM-Agrin die biophysikalischen Eigenschaften des AMPA Rezeptor/Shisa Komplexes verändert. Dies wird durch Expression aller drei Proteine in 293HEK Zellen und in embryonalen ZNS Neuronen mit Hilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen geschehen. Wir hoffen, dass diese Experimente zu einem besseren Verständnis der Funktion von Agrin im ZNS und zur Synaptogenese im Allgemeinen beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen