Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Konfokalmikroskop in der bewilligten Ausstattung wurde in mehreren Projekten eingesetzt: Zum einen wurden Proteine der Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) Familie bezüglich ihrer subzellulären Lokalisation untersucht. Dazu wurden fluoreszierende Fusionskonstrukte mittels Lebendzellmikroskopie untersucht. Subzelluläre Verteilungvorgänge wurden außerdem mittels UV-aktivierbarer/konvertierbarer Farbstoffe sowie quantitativ mittels FLIP und FRAP Experimenten analysiert. Außerdem die Funktion von SOCS-Proteinen für die Immunevasion von Toxoplasma gondii Parasiten getestet. Dazu waren die Aufstellung des Mikroskops im S2-Sicherheitsbereich und Möglichkeit zur Lebendzellmikroskopie essentiell. Des Weiteren wurde die Kolokalisation verschiedener SOCS Proteine mit der Serin/Threoninkinase Pim-1 untersucht. In einem weiteren Projekt wurde Integrität von siRNA während der Aufnahme in Zellen mittels FRET Analysen in Kooperation mit Prof. Mark Helm, Mainz studiert. Weiterhin wurde die Rolle von Bleb-artigen Zellfortsätzen in der Motilität von Tumorzellen analysiert, die zur Identifizierung einer für diese Zellfortsätze spezifischen Aktin Polymerisierungsmaschinerie führten. Ebenso wurde mit Hilfe des Gerätes der Einfluss des von HIV-1 kodierten Nef Proteins auf die Motilität von CD4+ T Lymphozyten studiert. Diese Untersuchungen konnten Nef als Inhibitor von Zellmotilität identfizieren und einen zugrunde liegenden molekularen Mechanismus aufklären. Weiterhin wurde das Gerät für Untersuchungen zum Mechanismus eingesetzt über den das HIV-1 Protein Vpu den zellulären Restriktionsfaktor CD317/Tetherin antagonisiert. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigen, dass Vpu spezifisch den anterograden Transport neu synthetisierter CD317 Moleküle inhibiert, um den Restriktionsfaktor zu inaktivieren. Die zelluläre Lokalisation von RAG, Ku70 und ZAP70 wurde in B Zellen nach Stimulation mit TLR9 Liganden untersucht. Ebenfalls konnte die Translokation von SOCS und PIM-1 in Zellen, die mit dem bakteriellen Toxin PMT stimuliert waren, bestimmt werden. Schließlich wurden umfangreiche Untersuchungen zur zellulären Aufnahme und Verteilung von DNA-RNA-Hybrid-Molekülen vorgenommen. Diese Konstrukte sind geeignet, antagomir und siRNA Moleküle effizient in Zellen zu einzubringen. Außerdem wurde das beantragte Mikroskop eingesetzt, um Interaktionpartner einer calcium-abhängigen Proteinkinase des Malariaerregers zu ermitteln. Dies ist in der parasitären Vakuole des Parasiten und damit sozusagen in einem extraparasitären Kompartment des Parasiten lokalisiert. Mittels FRET Analysen wurden Interaktionspartner dieser Kinase charakterisiert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2008). Identification of a nuclear localization signal in suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). FASEB J 22(12): 4296-4305
Baetz A, Koelsche C, Strebovsky J, Heeg K, Dalpke AH
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(2008). The Diaphanous Related Formin FHOD1 Associates with ROCK1 and Promotes Srcdependent Plasma Membrane Blebbing. J. Biol. Chem., 283: 27891-27903
Hannemann, S., Madrid, R., Stastna, J., Kitzing, T., Gasteier, J., Schönichen, A., Bouchet, J., Jimenez, A., Geyer, M., Grosse, R., Benichou, S. and Fackler, O.T.
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(2009). HIV-1 Antagonism of CD317 is Species-Specific and Involves Vpu-Mediated Proteasomal Degradation of the Restriction Factor. Cell Host and Microbe, 5: 285-297
Goffinet, C., Allespach, A, Homann, S., Tervo, H-M., Habermann, A., Rupp, D., Oberbremer, L., Kern, C., Tibroni, N., Welsch, S., Krijnse-Locker, J., Banting, G., Kräusslich, H.G., Fackler, O.T. and Keppler, O.T.
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(2009). HIV-1 Nef interferes with host cell motility by deregulation of cofilin. Cell Host and Microbe, 6: 174-186
Stolp, B., Reichman-Fried, M., Abraham. L., Pan, X., Giese, S.I., Hannemann, S., Goulimari, P., Raz, E., Grosse, R. and Fackler, O.T.
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(2009). Inhibition of T cell receptor induced actin remodeling and relocalization of Lck are evolutionarily conserved activities of lentiviral Nef proteins. J. Virol., 83: 11528-11539
Rudolph, J.M.; Eickel, N., Haller, C., Schindler, M. and Fackler, O.T.
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(2009). Structural and functional analysis of a nuclear localization signal (NLS) in SOCS1. Mol Immunol. 46 (13): 2474-2480
Koelsche C, Strebovsky J, Baetz A and Dalpke AH
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(2010). Antagonism of CD317 restriction of HIV-1 particle release and depletion of CD317 are separable activities of HIV-1 Vpu. J. Virol., 84: 4089-4094
Goffinet, C., Homann, S., Ambiel, I., Tibroni, N., Rupp, D., Keppler, O.T. and Fackler, O.T.
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(2010). Lentiviral Nef Proteins Utilize PAK2-mediated Deregulation of Cofilin as a General Strategy to Interfere with Actin Remodeling. J. Virol., 84: 3935-3948
Stolp, B., Abraham, L., Rudolph, J.M. and Fackler, O.T.
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2010. Pasteurella multocida Toxin-induced Pim-1 expression disrupts suppressor of cytokine signalling (SOCS)-1 activity. Cellular Microbiology 12: 1732–1745
Hildebrand, D., P. Walker, A. Dalpke, K. Heeg, and K. F. Kubatzky
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(2011). Suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) limits NFκB signaling by decreasing p65 stability within the cell nucleus. FASEB J. 25(3): 863-874
Strebovsky J, Walker P, Lang R .and Dalpke AH
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(2012). Differing and isoform specific roles for the formin DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation. Cell Research, 22: 728–745
Stastna, J., Pan, X.Y., Wang, H., Kollmannsperger, A., Kutscheidt, Cell Research, 22: 728–745 S., Lohmann, V., Grosse, R. and Fackler, O.T.
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Pasteurella multocida and immune cells. Curr. Top Microbiol Immunol. 2012; 361: 53-72
Kubatzky, K.F.
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2013. PTO-modified CpG oligodeoxynucleotides mimic autoantigens and reveal a potential role for TLR9 in receptor revision. Immunology 139: 166–178
Doster, A., S. Ziegler, S. Foermer, R. J. Rieker, K. Heeg, and I. Bekeredjian-Ding
