Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehung und biologischen Bedeutung von Adenylat bildenden Enzymen aus Arabidopsis thaliana
Final Report Abstract
Adenylat bildende Enzyme nehmen eine zentrale Funktion in vielen anabolen und katabolen Stoffwechselwegen ein. Sie katalysieren die Aktivierung von Carbonsäuren, die in zwei Reaktionsschritten zunächst mit ATP zu einem AMP-Anhydrid (dem Adenylat) und nachfolgend durch Übertragung auf einen Acyl-Akzeptor, meistens Coenzym A, zu einem energiereichen CoA-Ester umgesetzt werden. In diesem Projekt wurde eine Gruppe von neun Proteinen aus Arabidopsis thaliana untersucht, die aufgrund ihrer Sequenz- und Strukturähnlichkeiten zu 4-CumaratCoA-Llgase (4CL) als putative Adenylat bildende Enzyme im sequenzierten Arabidopsis Genom identifiziert wurden, deren biochemische und biologische Funktion bisher aber unbekannt war. Zunächst wurde versucht die aktivierten Substrate durch molekulares Modellieren der Substratbindungstasche und "docking" für ausgewählte Vertreter dieser 4CL-ähnllchen Proteine (4CLL) vorherzusagen bzw. einzugrenzen. Diese Vorhersagen konnten experimentell aber nicht verifiziert werden. Daraufhin wurde die umfassende, funktionelle Charakterisierung aller 4CLLs experimentell durchgeführt Dazu wurden alle Proteine kloniert heterolog exprimiert, aufgereinigt und einem umfangreichen "screen" auf aktivierte Substrate mit mehr als 100 Carbonsäuren aus unterschiedlichen chemischen Strukturklassen unterzogen. Dabei zeigte sich, dass sechs der untersuchten Proteine Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlängen umsetzen, nicht nur in vitro sondern auch in vivo, was durch Komplementatlon eines Acyl-CoA-Synthetase-defizienten E. coli-Stammes nachgewiesen wurde. Somit stellen 4CLLs aus Arabidopsis, neben den bereits bekannten Acyl-CoA-Synthetasen, die langkettige Fettsäuren aktivieren (LACS), eine weitere Gruppe von Fettsäure aktivierenden Acyl-CoA- Synthetasen dar. Einige 4CLLs aktivieren darüber hinaus sehr selektiv, spezifische Substrate, wie zum Beispiel Vorstufen der Phytohormone Jasmonsäure (JA) und Indolessigsäure (IAA) oder Hydroxyfettsäuren. Das Protein At1g20510 konnte als OPC-8:CoA-Ligase (0PCL1) Identifiziert werden, dass eine Zwischenstufe der JA-Biosynthese, OPC-8, zum entsprechenden CoA-Ester aktiviert und damit dessen ß-Oxidation einleitet Ein Enzym mit dieser Funktion war bisher nicht bekannt und seine Beteiligung an der JA-Biosynthese in vivo konnte durch Untersuchung der Arabidopsis Verlustmutanten des entsprechenden Gens bestätigt werden. Mit At4g05160 und At5g63380 konnten erstmals Enzyme beschrieben werden, die Indolbuttersäure (IBA) zum CoA-Ester aktivieren und damit an der Umwandlung zu Indolessigsäure (IAA) beteiligt sind. Obwohl die Aktivität beider Enzyme in vitro sehr gering ist, enthält die Arabidopsis Doppelmutante beider Gene veränderte Mengen an IAA und IBA und zeigt darüber hinaus eine deutliche, phänotypische Reaktion auf IBA- Behandlung (Wurzelwachstum). Schließlich konnte für das Protein At1g62940 gezeigt werden, dass es zeitlich begrenzt und nur in einer speziellen Zellschicht von Blütenknospen, dem Tapetum, exprimiert ist und vorzugsweise Hydroxyfettsäuren aktiviert, die als Bausteine für die Biosynthese der Pollenzellwand (Sporopollenin) dienen. Insgesamt ergeben die durchgeführten Untersuchungen ein umfassendes Bild einer Gruppe von Adenylat bildenden Enzymen, die als neuartige CoA-Ligasen spezielle und wichtige Funktionen in unterschiedlichen Stoffwechselwegen von A. thaliana übernehmen.
Publications
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