Die Rolle von Adaptorproteinen bei der Regulation unterschiedlicher Signaltransduktionswege: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Adaptorproteins Intersectin
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Adaptorproteine rekrutieren ihre Bindungspartner zu spezifischen Orten in der Zelle. Durch die Bindung von mehreren Liganden fungieren sie ausserdem als Interaktionsplatformen. Voraussetzung dafür ist ihre modulare Beschaffenheit, sie bestehen aus Protein-Protein- Interaktionsdomänen (PID), die spezifische Aminosäuresequenzen (Motive) in ihren Partnern erkennen. Unser Ziel war es, am Beispiel von zwei unterschiedlichen PID, den SH3- Domänen und EH-Domänen, zu verstehen, wie diese Domänen aus einem Pool von ähnlichen Bindungsmotiven die zu dem Zeitpunkt richtigen Partner selektieren können und wie benachbarte Regionen im Protein das Bindungsverhalten einzelner Domänen beeinflussen. Wir konnten verschiedene Formen der Regulation und Modulation von Ligandenbindung beschreiben: Im Fall der EH-Domänen, für die bisher nur eine sehr geringe Selektivität und Affinität bezüglich ihrer Interaktion mit Liganden festgestellt wurde, haben wir zB. beim Protein Eps15 eine sehr hoch-affine Ligandenbindung beobachtet. Mit Hilfe von Bindungsstudien und der NMR-Struktur des Komplexes, konnten wir zeigen, dass nicht wie erwartet ein sondern zwei Motive gleichzeitig an die Domäne binden. Während das erste Motif die kanonische Bindungstasche erkennt, interagiert das zweite Motif mit einer zuvor nicht identifizierten Region. Hier tragen flankierende Aminosäuren besonders zu der spezifischen und bisher einzigartigen Bindung bei. Die Reste der EH-Domäne, die diese neue Tasche bilden sind evolutionär konserviert und kommen in keiner weiteren EH-Domäne vor. Bei mehreren SH3-Domänenproteinen sehen wir dagegen, dass die Anwesenheit von multiplen SH3-Domänen zu einer Kooperativität bei der Bindung des Liganden führt. So bilden beim Protein FISH/TKS5 die beiden N-Terminalen SH3-Domänen eine Einheit, die nur in Anwesenheit beider Domänen mit Peptid-oder Proteinliganden interagiert. Diese Einheit wird durch eine kurze Spliceinsertion so verändert, dass sie unterschiedliche Peptide erkennt. Daegegen ist im Multidomänenprotein Intersectin, mit insgesamt fünf SH3- Domänen, die Interaktion mit dem Liganden N-WASP, der entsprechend über sehr viele SH3-Bindungsmotive verfügt, aviditätsgetrieben. Je mehr intakte SH3-Domänen anwesend sind, desto höher ist die gemessene Affinität. Neben der Charakterisierung der Bindungsmodi, wurde die Nukleotidaustauschaktivität von Intersectin im Detail untersucht. Die DH-Domäne von Intersectin beschleunigt den Nukleotidaustausch und somit die Aktivierung der GTPase Cdc42 um bis zu vier Grössenordnung. Diese Aktivität ist Intersectin fl deutlich reduziert. Uns war es möglich mittels Stopped-flow Messungen und Mutationsanalysen, die inhibierende Region zu definieren. Hierbei handelt es sich um eine kurze Aminosäuresequenz zwischen den SH3-Domänen und der Austauschregion, die sterisch die Bindung von Cdc42 verhindert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Spectroscopic methods for the determination of protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 2005;Chapter 20:Unit 20.8.
Groemping Y, Hellmann N
- 1H, 13C, and 15N chemical shift assignments for the Eps15-EH2-stonin 2 complex. Biomol NMR Assign. 2008, 2:55-8.
Rumpf J, Simon B, Groemping Y, Sattler M
- Structure of the Eps15-stonin2 complex provides a molecular explanation for EH- domain ligand specificity. EMBO J. 2008, 27:558-69
umpf J, Simon B, Jung N, Maritzen T, Haucke V, Sattler M, Groemping Y
- Characterisation of the nucleotide exchange factor ITSN1L: evidence for a kinetic discrimination of GEF-stimulated nucleotide release from Cdc42. J Mol Biol. 2009, 387:270-83
Kintscher C, Groemping Y
- Isoform-selective interaction of the adaptor protein Tks5/FISH with Sos1 and dynamins. J Mol Biol. 2009, 390:939-50
Rufer AC, Rumpf J, von Holleben M, Beer S, Rittinger K, Groemping Y
- Autoinhibition of GEF activity in Intersectin 1 is mediated by the short SH3-DH domain linker. Protein Sci. 2010, 19:2164-74
Kintscher C, Wuertenberger S, Eylenstein R, Uhlendorf T, Groemping Y
