In situ Identifikation und Aktivitätsmessung von mikrobiellen Aggregaten in der biologischen Abwasserreinigung durch konfokale Resonanz-Raman-Mikroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen Projektes wurde die konfokale Resonanz-Raman-Mikro-Spektroskopie zur Untersuchung von Biofilmen evaluiert. Der Betrieb von Sequencing Batch Reaktoren (SBR) zur ANAeroben AMMoniak Oxidation (ANAMMOX) von Abwässern diente dabei als konkretes Anwendungsfeld. Es zeigte sich, dass bei den hierbei erzeugten Biofilmen ca. 4% eines Granulums innerhalb von 1,5h ramanmikroskopisch bei einer Laserleistung von 20 mW/cm² untersucht werden können ohne die Probe erkennbar zu beschädigen. Diese Werte ergaben sich als optimaler Kompromiss aus methodischen Anforderungen und Probenbeschaffenheit, wie Stärke der signifikanten Ramanlinien, Zelladhäsion im Biofilm und räumlicher Auflösung im Vergleich zu interessanten Strukturen. Die SBR Reaktoren mussten zwei Mal angefahren werden, da der sich im ersten Ansatz ausbildende Bakterienrasen des Biofilms zu großen Teilen aus Purpurbakterien bestand, die eine verlässliche Analyse verhinderten. Im Zweiten Ansatz wurde der ANAMMOX Prozess erfolgreich in Gang gesetzt und es wurden erfolgreich die vorherrschenden Nitrifizierer im Biofilm nachgewiesen. Sowohl das prozesstechnisch missglückte erste Anfahren der Reaktoren, als auch der erfolgreiche zweite Ansatz lieferten interessante und für das Projekt wertvolle ramanspektroskopische Daten. Im Zusammenspiel mit Vergleichsmessungen an Reinkulturen konnten Ramansignaturen gefunden werden, die entweder spezifisch für kleine Bakteriengruppen oder größere Bakterienklassen waren. Für die Zuordnung von Ramanspektren einzelner Bakterien zu diesen Gruppen und damit ihrer Identifikation im Biofilm wurden verschiedene Algorithmen zur Hierarchischen Cluster Analyse untersucht. Es zeigte sich beispielsweise, dass Weighted-Average-Linkage in diesem Zusammenhang der zu bevorzugende Algorithmus ist, während der in diesem Anwendungsbereich weit verbreitete Ward-Algorithmus noch gute Ergebnisse liefert. Durch die ramanmikroskopischen Untersuchung der Biofilmgranula aus den Reaktoren konnten verschiedene Informationsstränge verfolgt werden: z.B. welche der identifizierten Bakterien sich unter den gegebenen Bedingungen wo im Biofilm (Oberfläche, im Rasen, an Wasserkanälen) ansiedeln. Die aktive Schicht der untersuchten Biofilme war typischerweise 30 µm dick, von Tunneln und Verwerfungen geprägt und die Granula waren in Abhängigkeit von der Beschickungsstrategie mit Nährstoffen unterschiedlich fest. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass der Präparation von Bakterien bei nachfolgender ramanmikroskopischer Messung erhebliche Aufmerksamkeit geschenkt werden muss. Fixierung von Bakterien mittels Erhitzen, Ethanol oder Formaldehyd zog z.T. kritische Veränderungen der Ramanspektren nach sich. Auch die Aufbringung der Bakterien auf Mikroskopträger mit adhäsiver Beschichtung hatte bei bestimmten (kleinen) Zellen Auswirkung auf die Qualität des Ramansignals.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"Analyzing Bacterial Adhesion Forces Within Anaerobic Granules by Confocal Resonance Raman Microscopy". In: Abstract Handbook of Biofilm Technologies Conference, 8 - 10 January 2008, Singapore
A.-K. Kniggendorf, J. Haneke, I. Wesoly, T. Gaul, Angelika Anders
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„Konfokale Resonanz-Raman-Mikroskopie - Präparationsfreie in situ Analyse von Bakterien in komplexen mikrobiellen Aggregaten“. BIOforum 4, S. 39–41, GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt (2008)
Ann-Kathrin Kniggendorf, Angelika Anders-von Ahlften
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"Novel tools for in situ detection of biodiversity and function of dechlorinating and uranium-reducing bacteria in contaminated environments". Geochimica et Cosmochimica Acta 73(13 Sup.1), p. A502 (2009)
K. Hauer, D. B. Meisinger, M. Pavlekovic, S. H. Thomas, A.-K. Kniggendorf, J. Chee-Sanford, R. Sandford, C. A. Lebrón, W. Liebl, F. E. Loeffler, N. M. Lee
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„Effects of Ethanol, Formaldehyde, and Gentle Heat Fixation in Confocal Resonance Raman Microscopy of Purple NonSulfur Bacteria“. Microscopy Research and Technique, (2010)
A.-K. Kniggendorf, T. Gaul, M. Meinhardt-Wollweber
