CCA-addierende Enzyme mit erhöhter Substrat-Affinität: Strategien und Konsequenzen der Adaptation an RNA-Substrate

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professor Dr. Mario Mörl; Professorin Dr. Sonja Prohaska
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 535682526

tRNA-Nukleotidyltransferasen sind die einzigen bekannten RNA-Polymerasen, die eine spezifische Sequenz (C-C-A) an ihrem Substrat (tRNA) synthetisieren, ohne eine externe Nukleinsäure-Matrize zu verwenden. Stattdessen verwenden sie entweder eine Kombination aus tRNA-Substrat und einem konservierten Arginin-Rest im katalytischen Zentrum (Klasse I, in Archaea) oder ein Aminosäure-Template, bei dem spezifische Seitenketten Watson-Crick-ähnliche Wasserstoffbrückenbindungen mit CTP und ATP ausbilden (Klasse II). Die letztgenannte Klasse der CCA-addierender Enzyme kommt in Bakterien und Eukaryonten vor und weist eine sehr ungewöhnliche Eigenschaft auf: Diese Enzyme stellen zwar effiziente Katalysatoren dar, haben aber in der Regel eine sehr geringe Affinität zu ihrem tRNA-Substrat. Wir haben vor kurzem mehrere Ausnahmen von dieser Regel beobachtet und CCA-addierende Enzyme der Klasse II identifiziert, die eine erhöhte tRNA-Affinität aufweisen. In den meisten Fällen haben es diese Enzyme mit bizarren, miniaturisierten, hairpin-ähnlichen tRNAs zu tun, und die verstärkte Substratinteraktion scheint eine evolutionäre Strategie darzustellen, um solch unkonventionellen Substrate für die Polymerisation zu erkennen und zu binden. Darüber hinaus zeigte die Rekonstruktion eines anzestralen CCA-addierenden Enzyms aus Gamma-Proteobakterien ebenfalls eine erhöhte tRNA-Affinität. Interessanterweise deuten unsere Daten darauf hin, dass die identifizierten Enzyme unterschiedliche Strategien für diese effiziente Substratbindung verfolgen. In diesem Antrag schlagen wir vor, die verschiedenen Strategien für die Substratinteraktion und ihre Auswirkungen auf die Polymerisationseffizienz und -genauigkeit zu untersuchen. In einem bioinformatischen Ansatz werden wir weitere Enzymkandidaten identifizieren, die ungewöhnliche tRNA-Substrate haben, und diese Enzyme werden sowohl in vivo als auch in vitro eingehend untersucht. Darüber hinaus hat unsere bioinformatische Analyse eine große Anzahl ungewöhnlicher Klasse-II Enzyme in Archaea aufgedeckt (wo normalerweise nur Klasse-I-Enzyme vorkommen), und wir werden deren Funktionalität und Co-Evolution mit den zusätzlich vorhandenen archaealen Klasse-I-Enzymen untersuchen. Mit diesen Projekten wollen wir klären, wie und warum CCA-addierende Enzyme der Klasse II eine so überraschende evolutionäre Plastizität in Bezug auf Substraterkennung und Polymerisationsmodus aufweisen und wie die ungewöhnliche Kombination von Klasse-I und Klasse-II Enzymen in Archaea zusammenarbeitet.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen