Echtzeit-Untersuchung von ADAT-Aktivität und -Inhibition unter Verwendung neu entwickelter fluoreszenter Nukleotide

• Antragstellerin: Dr. Julia Dietzsch
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 535949581

tRNA enthält eine große Anzahl natürlicher Nukleosidmodifikationen, wobei Inosin die häufigste davon ist und durch enzymatische Deaminierung mithilfe sogenannter tRNA-Deaminasen (ADATs) eingeführt wird. Obwohl bekannt ist, dass A-zu-I-Editing eine wichtige Rolle in der tRNA-Reifung spielt und die Entstehung unterschiedlicher Krankheitsbilder beeinflusst, sind viele Fragen hinsichtlich der biologischen Funktion von Inosin im Anticodon-Loop und des Einflusses von ADAT-Mutationen auf neurologische Entwicklungsstörungen noch offen. Die derzeit bekannten Methoden, um Adenosin-Deaminierung zu verfolgen, basieren auf Radioisotopen-Markierung und cDNA-Sequenzierung, wobei diese verschiedenen Nachteile wie zum Beispiel eine zeitaufwendige Probenvorbereitung und eine niedrige Sensitivität aufweisen. Das Ziel dieses Projekts ist es daher, fluoreszenzbasierte Methoden für die Echtzeituntersuchung von ADAT-Aktivität und -Inhibierung zu entwickeln, um Hochdurchsatz-Screening von ADAT-Inhibitoren zu vereinfachen. Um ein effizientes Auslesen mithilfe von Fluoreszenz zu erreichen, sollen emittierende isomorphe Nukleosidanaloga direkt an verschiedenen Positionen natürlich vorkommender tRNA-Konstrukte eingebaut werden. Für diese Anwendung scheinen Thieno- und Isothiazolopyrimidine (thN und tzN), die zu dem in der Gruppe von Yitzhak Tor entwickelten emittierenden Nukleobasenalphabet gehören, vielversprechende Kandidaten zu sein, da Deaminierung dieser künstlichen Nukleoside zu einer Änderung ihrer spektroskopischen Eigenschaften führt. Die entsprechenden Nukleoside sollen daher als Phosphoramidit-Bausteine für den Einbau in die gewünschten tRNA-Sequenzen über Festphasensynthese und auch als Triphosphate hergestellt werden. Über spektroskopische Untersuchung sollen wichtige photophysikalische Parameter der dadurch erhaltenen modifizierten Systeme bestimmt werden und anschließende in vitro Deaminierung soll Aufschluss darüber geben, die Modifikation welcher Position zu der effizientesten Detektion von Deaminierung führt. Weitere Experimente zielen darauf ab, die biologische Relevanz der Methylierung von Inosin nach der Deaminierung und die Rolle von tRNA-Fragmenten, die durch Anticodon-Spaltung entstehen, aufzuklären. In einem weiter fortgeschrittenen Status des Projekts sollen die emittierenden tRNAs für biochemische in vivo Untersuchungen zur Identifizierung potentieller ADAT-Inhibitoren verwendet werden, wobei das Langzeitziel darin besteht, tRNA und tRNA-Fragmente spektroskopisch verfolgen zu können. Der zweite Teil des Projekts beinhaltet das Design, die Synthese und Charakterisierung neuer fluoreszenter Nukleoside mit verbesserten spektroskopischen Parametern. Abgeleitet von der Struktur des antiviralen Nukleosides Remdesivir wird erwartet, dass die photophysikalischen Eigenschaften dieser neuen Verbindungen sensitiv auf Deaminierung reagieren und diese daher eine geeignete Alternative zu den berichteten thN und tzN Nukleosiden darstellen.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle