Beschleunigung der genetischen Diagnostik der hereditären spastischen Paraplegie durch Kombination von Short- und Long-Read Whole Genome Sequencing mit der funktionellen Charakterisierung identifizierter Varianten mittels CRISPRi in aus iPSC-generierten Neuronen

• Antragstellerin: Dr. Luca Magdalena Schierbaum
• Fachliche Zuordnung: Kinder- und Jugendmedizin
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 536105452

Einleitung: Hereditäre spastische Paraplegie (HSP) bezeichnet eine Gruppe von mehr als 80 genetischen Erkrankungen, die durch fortschreitende Schwäche und Spastik der unteren Extremitäten gekennzeichnet ist. HSP, die sich im Kindesalter manifestiert, und über 80 bekannte ursächliche Gene aufweist, ist eine komplexe Erkrankung, bei der die genaue genetische Diagnosestellung und das Verständnis der zugrundeliegenden genetischen Mechanismen eine Herausforderung darstellt. Derzeit liegt die Diagnoserate für HSP nur bei etwa 40-50%. Dies ist teilweise auf die Schwierigkeit zurückzuführen, die Pathogenität von identifizierten Genvarianten zu bestimmen. Dieses Forschungsprojekt hat das Ziel, die genetische Diagnose von HSP zu beschleunigen. Für diesen Zweck werden short-read und long-read whole genome sequencing (srWGS, lrWGS) kombiniert, gefolgt von einer funktionellen Charakterisierung identifizierter Varianten mittels CRISPRinterference (CRISPRi) in aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnenen Neuronen. Methoden und erwartete Ergebnisse: In diesem Projekt wird bei HSP-Patienten mit negativer klinischer Exom-Testung srWGS durchgeführt. Die so gewonnenen Daten werden mit Hilfe etablierter Pipelines nach Einzelnukleotidvarianten (single nucleotide variants, SNVs), strukturellen Varianten (SVs) und Repeat Expansionen (REs) in bekannten Genomregionen gefiltert. Zusätzlich werden neue Filteralgorithmen entwickelt, um Varianten in nicht-kodierenden Regionen, novel REs und mitochondriale Varianten zu analysieren. Die Varianten werden auf Grundlage verschiedener Kriterien wie Häufigkeit in Populationsdatenbanken, in-silico-Predictiontools, Constraint Scores, Protein- und Genfunktion, regulatorische Elemente sowie assoziierte Krankheiten und Phänotypen auf ihre Pathogenität hin untersucht. Varianten von unklarer Signifikanz, die sich auf das Spleißen auswirken könnten, werden mittels lrWGS und RNA-Sequenzierung untersucht. Zur funktionellen Charakterisierung der identifizierten Varianten mit Funktionsverlust wird eine Pipeline mit CRISPRi in aus iPSC generierten Neuronen entwickelt. Zuerst werden CRISPRi-Klone durch Integration von pC13N-dCas9-BFP-KRAB am CLYB-Lokus in iPSCs, die ein durch Doxycyclin-induzierbares Maus-Neurogenin 2 am AAVS1-Lokus tragen, erzeugt. Dann werden einzelne single guide RNAs (sgRNAs) mittels lentiviraler Vektoren eingebracht. Eine automatisierte, nicht invasive Bildgebung und Messung des Neuritenwachstums werden nach erneuter Aussaat der Zellen zur standardisierten, quantifizierbaren Datenerfassung genutzt. Schlussfolgerung: Dieser umfassende Ansatz zielt darauf ab, potenziell krankheitsverursachende Varianten für HSP zu identifizieren und Einblicke in die der Krankheit zugrundeliegenden genetischen Mechanismen zu gewinnen. Die Ergebnisse dieser Studie werden zur Entwicklung präziserer und skalierbarer Diagnosemethoden sowie personalisierter Behandlungsstrategien für Patienten mit HSP beitragen.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Dr. Darius Ebrahimi-Fakhari, Ph.D.