Kommunikation zwischen genetischen Netzwerken als logistische Voraussetzung für die Aminosäureversorgung der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae
Final Report Abstract
Schwerpunkt unserer Arbeiten waren die beiden Proteine Gcn4p und Asc1p/Cpc2p und ihre entsprechenden Gene. Gcn4p ist als Transkriptionsfaktor und Asc1p als Komponente des Ribosoms für die Versorgung einer Hefe-Zelle mit Aminosäuren notwendig. Wir haben in der vergangenen Periode den Abbau von Gcn4p genauer untersucht. Wir konnten zeigen, dass Gcn4p durch das Cyclin Pcl5p im Kern erkannt werden muss, um phosphoryliert und dann abgebaut zu werden. Die Substratbindedomäne wurde identifiziert. Die C-terminale Kernlokalisierungssequenz kann durch eine andere N-terminale ersetzt werden, ein cytoplasmatisches Cyclin ist jedoch nicht in der Lage, um Gcn4p zu phosphorylieren und zu instablisieren. Wir konnten weiter zeigen, dass es einen Feedback- Mechanismus gibt zwischen Gcn4p-Aktivität und Stabilität, indem Gcn4p seinen eigenen Abbau kontrolliert. Gcn4p kontrolliert die Expression des Cyclin-Gens PCL5. Wir konnten eine Variante identifizieren (Gcn4pLeu267Ser), bei der die Expression von PCL5 und damit die Zerstörung von Gcn4pLeu267Ser selbst reduziert ist. Diese Variante kann dann allerdings nur noch einen Teil der zellulären Gcn4p-Aktivität übernehmen und ist nicht mehr zur Adhäsion und Filamentbildung in der Lage. Durch dieses sich selbst kontrollierende System besteht eine gewisse Flexibilität gegenüber Mutationen innerhalb des Gens für den Transkriptionsfaktor, die als reziproke Korrelation zwischen Gcn4p transkriptioneller Aktivität und Stabilität eine gewisse Flexibilität und Anpassung der Zelle erlauben. Wir konnten weiter zeigen, dass Gcn4p den Transkriptonsfaktor Hac1p für seine Funktion benötigt. Sowohl in haploiden als auch in diploiden Hefezellen wird Hac1p für die vollständige Expression von Gcn4p-abhängigen Promotoren benötigt. Weiter beeinflussen sich beide Transkriptionsfaktoren direkt über die jeweilige mRNA-Menge für den jeweiligen Transkriptionsfaktor. Wir konnten zeigen, dass Hac1p auch für die Expression von FLO11 und damit die Adhäsion von Hefen benötigt wird. Insgesamt konnten wir eine komplexe gegenseitige Wechselwirkung zwischen beiden regulatorischen Netzwerken beschreiben. Eine Proteomanalyse von Hefen mit und ohne Aminosäure-Mangel (2-dimensionales DIGE) und ein Vergleich mit entsprechenden Transkriptom-Daten führte zur Identifikation von posttranskriptionell unterschiedlich exprimierten Proteinen. Eines dieser Proteine war Asc1p/Cpc2p. Die Deletion dieses Proteins, das sowohl ein Teil des Ribosoms als auch ein Teil eines heterotrimeren G-Proteins in der Zelle darstellen kann, führte zur Verlust von durch Aminosäure-Mangel induzierter Adhäsion als auch Defekten in der Expression des FLO11-Gens für das bei Hefen für die Morphogenese nötigen Adhäsin. Phosphoproteomund Western-Analyse zeigte, dass Asc1p/Cpc2 für die Phosphorylierung von Faktoren der Translation wichtig zu sein scheint. 13 Proteinen, die posttranskriptionell durch Aminosäuremangel kontrolliert wurden, konnten identifziert und ihre 5’ untranslatierten Regionen (5’UTR) genauer untersucht werden. Es zeigte sich aus bioinformatischen Analysen, dass es eine Korrelation mit A-reichen Sequenzen in der Nähe des Initiator- Codons in den 5’UTRs gibt, die bei Aminosäuremangel erhöht translatiert werden. Eine umfassende vergleichende Analyse zwischen Wildtyp und Δasc1-Deletionsmutante zeigte dass eine ganze Reihe zellulärer Prozesse in der Deletionsmutante beeinträchtigt sind. Dies betrifft die Aufnahme von Fe-Ionen, nitrosativen Stress und einen Wechsel von einem Atmungs- auf einen Fermentations-Stoffwechsel in der Deletionsmutante. Asc1p/Cpc2p wirkt auf Signaltransduktionswege wie den MAP Kinase-Weg, der für filamentöses Wachstum und Adhäsion und eine intakte Zellwand benötigt wird. Die erhaltenen Daten unterstützen eine Beteiligung des ribosomalen Asc1p/Cpc2p an Signaltransduktionswegen der Zelle.
Publications
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