RNA Dynamik mithilfe von smFRET und nsFCS aufklären und in hybride RNA Strukturmodelle integrieren (RNAdyn)

• Antragsteller: Professor Dr. Richard Börner
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 537331625

Im Mittelpunkt des Projektes steht die Untersuchung schneller intrinsischer Domänenbewegungen von fluoreszenz-markierten ribosomalen Ribonukleinsäuren (RNA) der Bäckerhefe. Als Modellsystems dient eine Sequenz der ribosomalen RNA, die einen Pseudoknoten bzw. einen kissing loop und dessen Interaktion mit einem GAAA-Tetraloop beinhaltet. Dieses Modellsystems soll mittels Nanosekunden-aufgelöster Korrelationsanalysen (nsFCS) und der multi-parameter Fluoreszenzdetektion (MFD) und der darauf aufbauenden pulsed-interleaved excitation (PIE) oder alternated laser exciation (ALEX) gestützten Farbstoff-sortierten Einzelmolekülaufgelösten Förster Resonanz Energietransfer (smFRET) Experimente untersucht werden. Durch die Korrelations-Analyse der Einzelphotonenzähldaten als Teil der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) können so Bewegungsmuster der Biomoleküle über theoretisch 10 Größenordnungen in der Zeit (ps - h) gewonnen werden. Wir werden dabei verschiedene Zeitbereiche untersuchen, die uns Auskunft über das Zeitregime von RNADomänenbewegungen (ps – ns evlt. bis in den μs-Bereich), s-Bereich), Tertiärkontaktformationen (μs-Bereich), s bis Sekunden) und Konformations- und Faltungsdynamiken (ms - Sekunden) geben werden. Durch die gleichzeitige Detektion zweier Farbkanäle im Rahmen von FRET-FCS Experimenten ist es möglich die antikorrelierte Änderung der Photonenzählraten direkt auf die Geschwindigkeitskonstante einer Abstandsänderung im Molekül abzubilden. Durch die gleichzeitige Aufspaltung des Messsignals auf zwei Polarisationskanäle (s und p) der beiden Farbkanäle ist zusätzlich die Geschwindigkeitskonstante einer Re-Orientierung der Farbstoffe während der aufgezeichneten Bewegungsmuster möglich. Letzteres gibt uns nicht nur Einblick in die Bewegungsfreiheit der Farbstoffe, ein wesentliches Kriterium für die Güte der Abstandinformationen im Rahmen eines FRET Experiments, sondern ermöglicht uns auch die Rotationsgeschwindigkeit des Biomoleküls als Ganzes bzw. seiner markierten Domänen zu untersuchen. Die so gewonnen zeitaufgelösten Abstandsinformation soll im zweiten Schritt für die Aufklärung von RNA Strukturen genutzt werden, indem sogenannte de novo Strukturmodelle bzgl. der gewonnen Abstandsinformationen der FRET-Trajektorie vorsortiert werden und so das simulierte Strukturensemble drastisch eingeschränkt wird (Stichwort: integrative / hybrid modelling). FRETbeschränkte MD Simulationen helfen uns die gewonnen Strukturen perfekt an das vorhergehende smFRET Experiment anzupassen. Unser Ziel ist es, nicht nur die FRET-assistierten Strukturmodelle von RNA zu verbessern, sondern die so gewonnen statischen Strukturbilder mit der Geschwindigkeits- bzw. Rateninformation quasi zum Leben zu erwecken und realistische Videosequenzen der Molekülbewegung zu ermöglichen. Dies stellt einen Meilenstein in der Bewertung biomolekularer Strukturen z.B. in der strukturbasierten Medikamentenentwicklung aber auch in der medizinischen Diagnostik dar.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen