Retrograde mitochondriale Signalübertragung in Fumarat-Hydratase-defizienten Zellen

• Antragsteller: Dr. Peter Gollwitzer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 537538941

Der Funktionsverlust der Fumarat-Hydratase (FH), einem Enzym des mitochondrialen Citratzyklus, ist Auslöser einer aggressiven Form des Nierenzellkarzinoms, bei der einzigartige Veränderungen des zellulären Stoffwechsels auftreten, darunter verstärkte Glykolyse bei beeinträchtigter oxidativer Phosphorylierung, erhöhte Verwertung von Glutamin und anderen Aminosäuren, sowie Akkumulation von Fumarat. Frühere Arbeiten unserer Gruppe haben gezeigt, dass die Hemmung des Citratzyklus und der Verlust der FH-Aktivität den „Integrated Stress Response“ (ISR)-Signalweg und somit den Transkriptionsfaktor ATF4 aktvieren, einen Hauptregulator von durch Nährstoffmangel verursachten Zellstress. Wie genau der Verlust der FH-Aktivität wahrgenommen und der Stoffwechsel entsprechend angepasst wird, ist jedoch unzureichend geklärt. In diesem Projekt werden wir anhand von kürzlich entwickelten zellulären Modellen der akuten FH-Defizienz die Mechanismen untersuchen, die vom Verlust der FH-Aktivität zur ATF4-Aktivierung führen, und darüber hinaus die Rolle von ATF4 bei der Anpassung des Stoffwechsels auf die FH-Defizienz untersuchen. Dazu werden wir einen auf Durchflusszytometrie basierenden CRISPR-Cas9-Knockout-Screen mit einem ATF4-Fluoreszenzreporter durchführen, um Regulatoren der ISR-Induktion bei FH-Verlust zu identifizieren. Wir werden eine mögliche Verbindung zur mitochondrialen ISR-Aktivierung durch die OMA1-DELE1-HRI-Achse überprüfen und entscheidende mitochondriale Parameter wie den Sauerstoffverbrauch, das Membranpotenzial der inneren mitochondrialen Membran, sowie mitochondriale Redoxpaare messen, um den unbekannten ISR-Aktivierungsmechanismus zu charakterisieren. Der Screen, sowie die Validierung der identifizierten Gen-Knockouts werden in physiologischen Zellkulturmedien durchgeführt, um die physiologischen Konzentrationen von Nährstoffen zu berücksichtigen. Desweiten werden wir uns auf die Folgen der ISR-Aktivierung konzentrieren und dabei die Interaktion von ATF4 mit dem mTOR-Signalweg untersuchen, welcher entscheidende Stoffwechselprozesse reguliert und eine bedeutende Rolle in FH-defizienten Tumoren spielt. Zu diesem Zweck werden wir Steady-State-Metabolomics Experimente in Wildtyp- und ATF4-defizienten Zellen durchführen, um die Rolle der ISR bei der Regulierung der intrazellulären Aminosäurekonzentrationen zu untersuchen. Eine mögliche, durch ATF4 vermittelte Aktivierung des mTORC1 Signalwegs wird durch Phosphoproteomik und durch Untersuchung der Phosphorylierung von etablierten mTORC1 Kinase Substraten überprüft. Durch die Aufklärung des molekularen Mechanismus der ISR-Aktivierung bei FH-Verlust und der Rolle von ATF4-abhängigen kompensatorischen Veränderungen des Stoffwechsels werden wir zum Verständnis der Anpassungen beitragen, die das Überleben FH-defizienter Zellen ermöglichen. Damit ermöglichen wir neue Strategien und Möglichkeiten bei der Suche nach einer zielgerichteten Therapie FH-defizienter Tumore.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle