Korrelation der Konformationsdynamik von eIF4A mit der eIF4A-, eIF4B- und eIF4G-Abhängigkeit der Translationseffizienz von mRNAs in Saccharomyces cerevisiae

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dagmar Klostermeier
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 537881349

Die Initiation der eukaryontischen Translation beginnt mit der Erkennung der 5‘-Kappe der mRNA durch eIF4F, einen Komplex aus der Helikase eIF4A, eIF4G und dem Kappen-Bindungsprotein eIF4E, gefolgt von der Rekrutierung des 43S Präinitiationskomplexes (PIC) und dessen Scannens zum Startcodon hin. Während dieser Prozesse entwindet eIF4A Strukturelemente in der 5‘-nicht-translatierten Region (5‘-UTR). eIF4B, 4G und die mRNA stimulieren die eIF4A-Aktivität, in dem sie den zugrunde liegenden Konformationszyklus modulieren; eIF4A ist damit ein zentrales Regulationselement in der Translation. Transkriptomweite Studien haben mRNAs identifiziert, deren Translation überdurchschnittlich von eIF4A, 4B oder 4G abhängt. Die molekulare Grundlage dafür ist jedoch noch unklar.Wir haben eine Reihe von S. cerevisiae-Stämmen hergestellt, mit denen wir Zellextrakte herstellen können, denen diese Faktoren einzeln oder in Kombinationen fehlen. Durch externe Zugabe der Faktoren können wir damit in vitro Translationsassays zur Bestimmung von Translationseffizienzen (TEs) sowie Einzelmolekül-FRET-Experimente zur Bestimmung der Konformationsdynamik von eIF4A unter identischen Bedingungen und über einen weiten Bereich an Konzentrationen von eIF4A, 4B und 4G durchführen. Aufbauend auf dieser Resource werden wir 1) die Hypothese testen, dass eIF4A-Abhängigkeit in vivo und in vitro korreliert ist mit der Fähigkeit der mRNA, die Konformationsänderungen von eIF4A zu stimulieren. Dazu werden wir Einzelmolekül-FRET-Experimente und Translationsassays mit Luziferase-Reportern, gekoppelt an die 5‘-UTR von mRNAs unterschiedlicher eIF4A-Abhängigkeit, durchführen. 2) mit Luziferase-Reportern und UTRs von mRNAs mit unterschiedlicher Abhängigkeit von eIF4B und 4G testen, inwieweit diese eIF4A-abhängige (mit Stimulation von eIF4A) und -unabhängige Effekte (ohne Stimulation von eIF4A) auf die Translationseffizienz der Reporter zeigen. Wir werden auch die Beiträge einzelner Domänen von eIF4B und 4G auf diese Effekte testen, Diese Experimente könnten Einblick in die Umprogrammierung der Translation in Krebszellen geben und helfen, ein minimales Translationssystem für Ansätze der synthetischen Biologie zu definieren. 3) die Hypothese testen, dass die Faktorabhängigkeit in der 5‘-UTR codiert ist. Dazu werden wir, ausgehend von Reportern mit 5‘-UTRs von mRNAs unterschiedlicher eIF4A-, 4B- und 4G-Abhängigkeit, (1) Strukturelemente aus der 5‘-UTR entfernen und auf Verlust der Faktorabhängigkeit testen bzw. (2) diese Elemente in die UTR einer faktorunabhängigen mRNA einführen und testen, ob dies hinreichend ist, um Faktorabhängigkeit zu erzeugen. Diese Experimente werden die Verbindung von eIF4A-Dynamik und TEs aufdecken, die eIF4A-abhängigen und - unabhängigen Effekte von eIF4B und 4G entschlüsseln, 5‘-UTR-Elemente definieren, die eine mRNA eIF4A-, 4B- oder 4G-abhängig machen, und damit insgesamt helfen, die Regulation der Translation und ihre Dysregulation in Krankheiten besser zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen