Charakterisierung bakterieller Ribonuklease P sowie der tRNA-Prozessierung in Aquifex aeolicus
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Wir konnten für das thermophile Bakterium T. thermophilus zeigen, dass das Leseraster des RNase P- Proteins (rnpA) komplett mit dem des ribosomalen Proteins L34 (rpmtf) in einem anderen Leseraster überlappt, ein bis dahin ungekannter Modus der Genexpression in Bakterien. Ein Schlüsselexperiment der Beweisführung war dabei die rekombinante Expression des RnpA-Proteins in 7. thermophilus sowie die massenspektroskopische Identifizierung der N-terminalen Verlängerung des Proteins. Die Ergebniss gaben Anlass zu einem "Highlight" in der renommierten Fachzeitschrift Trends in Biochemical Sciences. Die Ergebnisse der Komplementationsanalysen mit dem von uns konstruierten B. subtilis rnpA knockdown-Stamm d7 lassen sich wie folgt zusammenfassen; das rnpA-Gen ist essenziell in B. subtilis, die rnpA-Expression ist in ihrem natürlichen dicistroni sehen rpmH-rnpA-Kontext durch Transkriptionspolarität attenuiert und die Translation des RNase P-Proteins von B. subtilis kann an zwei alternativen Startcodons initiiert werden, N- und C-terminal His-getaggte Protein Varianten sind funktionell, die Funktionalität bakterieller RNase P-Proteine ist trotz geringer Sequenzkonservierung im gesamten Bakterienreich konserviert, Längen Variationen bzw. Deletionen werden in Regionen des Proteins toleriert, die nicht an der Interaktion mit der RNA-Untereinheit beteiligt sind, und archaeale oder eukaryontische RNase P-Proteine können das RnpA-Protein von B. subtilis in vivo nicht ersetzen und stellen somit sehr wahrscheinlich unabhängige evolutionäre Proteinrekruiterungen dar. Chimäre Holoenzyme (E. coli P RNA + B. subtilis P Protein und vice versa) sind sowohl in B. subtilis als auch E. coli funktionell, trotz zahlreicher biochemischer und biophysikalischer Unterschiede zwischen Enzymen des Typs A (E. coli) und Typs B (B. subtilis). Nach unseren Ergebnissen besteht die zentrale biologische Funktion bakterieller RNase P-Proteine in der Erhöhung der Affinität für 5'-Vorläufer-tRNAs; dies führt wiederum zu einer affineren Bindung von Schlüssel- Metallionen, die an der Substratpositionierung und Katalyse beteiligt sind, und ermöglicht so die Funktion des Enzyms bei physiologischen M g2+-Konzentrationen. In A. aeolicus ist weder ein Bakterien-typisches Gen für die Protein (rnpA)- noch die RNA (rnpB)-Untereinheit auffindbar. Wir konnten die Existenz einer RNase P-artigen Aktivität in A. aeolicus nachweisen, die sich jedoch in folgenden Punkten von RNase P-Enzymen anderer Bakterien, inklusive nächster Verwandter wie Aquifex pyrophilus, unterscheidet: durch Thiol-Oxidationssensitivität der Proteinkomponente(n), durch die Abwesenheit von RNA-Allein-Aktivität, die Nicht-Stimulierbarkeit zellulärer oder parziell gereinigter RNA-Fraktionen durch andere bakterielle RNase P-Proteine, sowie die weitgehende Resistenz gegenüber Micrococcal Nuclease. Ein RNomics-Ansatz führte zur Identifizierung des Riboregulators 6S RNA in A. aeolicus. Zudem wurde die RNase P in zwei weiteren Aquificales-Stammen, S. azorense and P. marina charakterisiert; hier wurden sowohl die RNA- als auch die Proteinuntereinheiten der RNase P identifiziert; das rnpA-Gen ist hier wie bei anderen Bakterien und im Gegensatz zu A. aeolicus und A. pyrophilus Teil des rpmH-rnpA-Qperons; die RNase P RNAs der beiden Aquificales zeigen einige Besonderheiten wie das Fehlen der Haarnadel P18, eine stabilisierte L9-P1-Interaktion, die die Abwesenheit des Interdomänenkontakts L18-P8 kompensiert, sowie mehrere Basenidentitaten in der Spezifitäts (S)-Domäne, die auch in der S-Domäne der RNase P RNA von T. thermophilus gefunden und dort als kritische Determinanten für die Mg2+-abhängigen Faltungseigenschaften dieser thermostabilen S-Domäne bestimmt wurden. Der besondere L9-Pl-Interdomänenkontakt der beiden thermostabilen Aquificales RNase P RNAs war Ausgangspunkt für die Studie. So konnten wir durch Mutationsanalyse am Beispiel der T. thermophilus RNase P RNA zeigen, dass diese L9-Pl-Interaktion tatsächlich eine erhöhte Stabilität verleiht und für die Aktivität bei höheren Temperaturen sowie für die Holoenzymaktivität bei niedrigen M g2+-Konzentrationen (2 or 4.5 mM Mg2+) kritisch ist. Der Einbau des T. thermophilus L9-P1-Moduls in die RNase P RNA von E. coli macht letztere zu einem thermostabilen Ribozym. Im Gegensatz zu den genannten RNase P RNAs aus thermophilen Bakterien ist der L9-Pl-Kontakt in mesophilen Bakterien wie E. coli funktioneil ohne Bedeutung, da Mutationen in der L9-Schleife weder in vitro noch in vivo einen Phänotyp verursachten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2002) tRNA maturation in Aquifex aeolicus. Biochimie. 84, 713-722
Willkomm DK, Feltens R & Hartmann RK
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Feltens R, Gößringer M, Willkomm DK, Urlaub H & Hartmann RK
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(2003) The enigma of Ribonuclease P evolution. Trends Genet. 19, 561-569
Hartmann E & Hartmann RK
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(2005) Experimental RNomics in Aquifex aeolicus: identification of small non-coding RNAs and the putative 6S RNA homolog. Nucleic Acids Res. 33, 1949-1960
Willkomm DK, Minnerup J, Huttenhofer A & Hartmann RK
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(2006) Analysis of RNase P protein (rnpA) expression in Bacillus subtilis utilizing strains with suppressible rnpA expression. J. Bacteriol. 188, 6816-6823
Gößringer M, Kretschmer-Kazemi Far R & Hartmann RK
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(2006) In vivo and in vitro investigation of bacterial type B RNase P interaction with tRNA 3'-CCA. Nucleic Acids Res. 35, 2060-2073
Wegscheid B & Hartmann RK
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(2006) The precursor tRNA 3'-CCA interaction with Escherichia coli RNase P RNA is essential for catalysis by RNase P in vivo. RNA 12, 2135- 2148
Wegscheid B & Hartmann RK
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(2006) Thermostable RNase P RNAs lacking P18 identified in the Aquificales. RNA 12, 1915-1921
Marszalkowski M, Teune JH, Steger G, Hartmann RK & Willkomm DK
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(2006) Type A and B RNase P RNAs are interchangeable in vivo despite substantial biophysical differences. EMBO Reports. 7, 411- 417
Wegscheid B, Condon C & Hartmann RK
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(2007) Function of heterologous and truncated RNase P proteins in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 66, 801-813
Gößringer M & Hartmann RK
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(2008) 5'-end maturation of tRNA in Aquifex aeolicus. Biol Chem. 389, 395-403
Marszalkowski M, Willkomm DK & Hartmann RK
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(2008) Structural basis of a ribozyme's thermostability: P1-L9 interdomain interaction in RNase P RNA. RNA 14, 127-133
Marszalkowski M, Willkomm DK & Hartmann RK
