Charakterisierung neuer Uhrengene im circadianen Modellsystem Neurospora
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Alle circadianen Systeme haben sich unter Synchronisation mit der zyklischen Umwelt entwickelt. Wir haben diese Eigenschaft daher erstmals zur Grundlage bei der Suche nach neuen Uhren-Genen in Neurospora crassa gemacht. Hierbei verwendeten wir drei verschiedene Ansätze (1) Insertional Mutagenesis. Im Laufe des Projektes mussten wir feststellen, dass die Selektionsmarker bei Neurospora nicht stabil eingebaut wurden und haben daher auf UV zur Mutagenese zurückgegriffen. Aus über 1.000 getesteten Kandidaten konnten wir 62 Entrainment-relevante Mutanten identifizieren. Eine Mutante, cosine, liegt in einer Region in der keine Uhrenge bekannt sind (Chromosom 1). Sie wurde detailliert physiologisch, proteomisch und genetisch beschrieben, und die Klonierung dieses Gens steht kurz vor dem Abschluss. (2) Knock-outs für Homologe bekannter Uhrengene anderer Organismen. Wir konnten zeigen, dass cryptochrome bei Neurospora, wie bei Tieren, ein Uhrengen ist. Dieses Ergebnis bestätigte die Wichtigkeit des in diesem Projekt verwendeten Ansatzes auf der Basis des Entrainments, da die cryptochrome Mutante unter konstanten Bedingungen keinen Phänotyp zeigt. (3) Kreuzung von Wildtyp-Stämme mit anschließender quantitative trait loci (QTL)-Analyse. Für verschiedene circadiane Phänotypen konnten mehrere Kandidatenregionen identifiziert werden (z.B. frequency) aber auch Regionen, in denen keine bekannten Uhrengene liegen (z.B. DA-25). Weiterhin haben wir den Chronotyp (phase of entrainment) von Neurospora crassa Wildtyp-Stämme und dessen mögliche Systematik mit der geographischen Lage am Ursprungsort (z.B. Breitengrad) untersucht. Wir haben die Methode zur Aufzeichnung molekularer circadianer Rhythmen auf Luziferase-Basis (Gooch et al., 2008, Eukaryot Cell, 7:28) molekulargenetisch (mit zahlreichen Konstrukten; promotor: cpc-1-LUC, cry- LUC, phy1-LUC, phy2_LUC, con-10-LUC, fluffy-LUC, vvd-LUC, frq-LUC; Fusions-Konstrukt: FRQ-LUC) und messtechnisch (Erweiterung der Messapparatur auf 120 Kanäle) weiterentwickelt. Hierdurch wird die Analyse von Mutanten und die Physiologie des Entrainments erheblich erleichtert und beschleunigt; zudem können nun Stämme untersucht werden, deren circadianer Rhythmus in race tubes nicht oder nur schwer aufgezeichnet werden kann, was für die meisten Wildtypen gilt. Die Erforschung der zellulären, molekularen Mechanismen des circadianen Systems muss durch theoretische Modelle unterstützt werden, um die möglichen Phänotypen einer Mutation simulieren und voraussagen zu können. Die Ergebnisse des theoretischen Teils dieses Projektes ermöglichten die Entwicklung neuer Screening Methoden und Verfahren, um zwischen circadianer Synchronisation und passiven Reaktionen gegenüber periodischen Außenreizen (masking) zu unterscheiden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2005) Circadian clocks - the fall and rise of physiology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6:965-971
Roenneberg T and Merrow M
- Demasking biological oscillators: properties and principles of entrainment exemplified by the Neurospora circadian clock. PNAS, USA, 2005, 102: 7742-7747
Roenneberg T, Merrow M and Dragovic Z
- Enhanced phenotyping of complex traits with a circadian clock model. Methods Enzymol. 2005;393:251-65
Merrow M and Roenneberg T
- Quantitative trait locus (QTL) analysis in Neurospora crassa for discovery of new circadian clock genes. in Fungal Genetics Conference. 2005. Asilomar
Boesl C, Turner E, Trevellin E, Jacobson DJ, Merrow M, Taylor JW, and Roenneberg T
- The distribution of chronotypes in Neurospora crassa. in Fungal Genetics Conference. 2005. Asilomar
Sultana S, Roenneberg T and Merrow M
- Entrainment of the Neurospora circadian clock. Chronobiology International, 2006, 23: 71–80
Merrow M, Boesl C, Ricken J, Messerschmidt M, Goedel M & Roenneberg T
- Functional genomics for discovery of new clock genes and mechanisms in the Neurospora crassa circadian clock. Chronobiology Summer School. 2006, Czech Republic
Lenssen D, Boesl C, Gödel M, Gromotka J, Roenneberg T and Merrow M
- New findings of Neurospora in Europe and comparisons of diversity in temperate climates on continental scales. Mycologia, 2006, 98: 550–559
Jacobson DJ, Dettman JR, Adams R, Boesl C, Sultana S, Roenneberg T, Merrow M, Duarte M, Marques I, Ushakova A, Carneiro P, Videira A, Navarro- Sampedro L, Olmedo M, Corrochano LM and Taylor JW
- Characterization of a new Neurospora crassa clock mutant. In Gordon Research Conference 2007
Goedel M, Diegmann J, Radic T, Merrow M and Roenneberg T
- Novel strategies for the identification of clock genes in Neurospora with insertional mutagenesis. Methods Mol Biol 2007;362:173-85
Sveric K, Mason M, Roenneberg T and Merrow M
- Modelling biological clocks. Current Biology, 2008, 18: 826-835
Roenneberg T, Chua EJ, Bernardo R & Mendoza E
- Molecular Chronobiology in fungi. In 8th Sino-German workshop on Cognitive Neuroscience: Art and Science. 2009. Munich
Gödel M
- Entrainment elicits period aftereffects in Neurospora crassa
Diegmann J, Stück A, Madeti C, Roenneberg T
- Genetic and Molecular Characterization of a Cryptochrome from the Filamentous fungus Neurospora crassa. Eukaryot Cell, 2010; (9) 5 (epub ahead of print)
Froehlich AF, Chen C, Belden WJ, Madeti C, Roenneberg T, Merrow M, Loros J & Dunlap JC
- Modeling a circadian surface. Journal of Biological Rhythms
Roenneberg T, Rémi J, Merrow M
