Charakterisierung neuer Uhrengene im circadianen Modellsystem Neurospora
Final Report Abstract
Alle circadianen Systeme haben sich unter Synchronisation mit der zyklischen Umwelt entwickelt. Wir haben diese Eigenschaft daher erstmals zur Grundlage bei der Suche nach neuen Uhren-Genen in Neurospora crassa gemacht. Hierbei verwendeten wir drei verschiedene Ansätze (1) Insertional Mutagenesis. Im Laufe des Projektes mussten wir feststellen, dass die Selektionsmarker bei Neurospora nicht stabil eingebaut wurden und haben daher auf UV zur Mutagenese zurückgegriffen. Aus über 1.000 getesteten Kandidaten konnten wir 62 Entrainment-relevante Mutanten identifizieren. Eine Mutante, cosine, liegt in einer Region in der keine Uhrenge bekannt sind (Chromosom 1). Sie wurde detailliert physiologisch, proteomisch und genetisch beschrieben, und die Klonierung dieses Gens steht kurz vor dem Abschluss. (2) Knock-outs für Homologe bekannter Uhrengene anderer Organismen. Wir konnten zeigen, dass cryptochrome bei Neurospora, wie bei Tieren, ein Uhrengen ist. Dieses Ergebnis bestätigte die Wichtigkeit des in diesem Projekt verwendeten Ansatzes auf der Basis des Entrainments, da die cryptochrome Mutante unter konstanten Bedingungen keinen Phänotyp zeigt. (3) Kreuzung von Wildtyp-Stämme mit anschließender quantitative trait loci (QTL)-Analyse. Für verschiedene circadiane Phänotypen konnten mehrere Kandidatenregionen identifiziert werden (z.B. frequency) aber auch Regionen, in denen keine bekannten Uhrengene liegen (z.B. DA-25). Weiterhin haben wir den Chronotyp (phase of entrainment) von Neurospora crassa Wildtyp-Stämme und dessen mögliche Systematik mit der geographischen Lage am Ursprungsort (z.B. Breitengrad) untersucht. Wir haben die Methode zur Aufzeichnung molekularer circadianer Rhythmen auf Luziferase-Basis (Gooch et al., 2008, Eukaryot Cell, 7:28) molekulargenetisch (mit zahlreichen Konstrukten; promotor: cpc-1-LUC, cry- LUC, phy1-LUC, phy2_LUC, con-10-LUC, fluffy-LUC, vvd-LUC, frq-LUC; Fusions-Konstrukt: FRQ-LUC) und messtechnisch (Erweiterung der Messapparatur auf 120 Kanäle) weiterentwickelt. Hierdurch wird die Analyse von Mutanten und die Physiologie des Entrainments erheblich erleichtert und beschleunigt; zudem können nun Stämme untersucht werden, deren circadianer Rhythmus in race tubes nicht oder nur schwer aufgezeichnet werden kann, was für die meisten Wildtypen gilt. Die Erforschung der zellulären, molekularen Mechanismen des circadianen Systems muss durch theoretische Modelle unterstützt werden, um die möglichen Phänotypen einer Mutation simulieren und voraussagen zu können. Die Ergebnisse des theoretischen Teils dieses Projektes ermöglichten die Entwicklung neuer Screening Methoden und Verfahren, um zwischen circadianer Synchronisation und passiven Reaktionen gegenüber periodischen Außenreizen (masking) zu unterscheiden.
Publications
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