Wirkmechanismen bei der Interaktion zwischen dem Antagonisten Pseudomonas syringae pv. syringae 22d/93, dem Pathogen Pseudomonas syringae pv. glycinea und der Sojabohne
Final Report Abstract
Der von einem symptomfreien Sojablatt isolierte Pseudomonas syringae pv. syringae Stamm 22d/93 (Pss22d) zeigte sowohl in vitro als auch in planta hervorragende antagonistische Eigenschaften gegenüber dem Erreger des Bakterienbrandes der Sojabohne Pseudomonas syringae pv. glycinea (Psg). Um die Mechanismen, die für diesen Antagonismus verantwortlich sind, zu charakterisieren, wurden die von Pss22d produzierten Antibiotika Syringopeptin, Syringomycin und die seltene Aminosäure 3-MethyIarginin (MeArg) untersucht. Durch eine Syringomycin/Syringopeptin-negative Doppelmutante konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die selektive in vitro Hemmung des Pathogens Psg allein auf der Wirkung des MeArgs beruht. Die in vitro Hemmimg konnte durch die Aminosäure L-Arginin aufgehoben werden, ein Hinweis darauf, dass MeArg direkt in die Biosynthese von Arginin oder einem Arginin-abhängigen Stoffwechselweg eingreift. Das stark polare MeArg wurde über lonenaustauschchromatographie und RP-HPLC aufgereinigt. Die Analyse der Struktur erfolgte über HR-ESI-MS/MS und NMR- Spektroskopie. MeArg wurde als seltene Aminosäure identifiziert, die sich nur durch eine Methylierung am dritten Kohlenstoff von Arginin unterscheidet und die die antibiotische Eigenschaft gegenüber dem nah verwandten Psg bedingt. Der Biosynthesecluster für MeArg besteht aus den mit vier Basenpaaren überlappenden Genen einer Methyltransferase und einer Aminotransferase sowie einem Aminosäure-Exporter, der Aminosäuren und aminosäureähnliche Verbindungen exkretiert. Die Gene der Methyltransferase und der Aminotransferase sind für die Synthese des MeArg verantwortlich, während der Exporter dieses aus der Zelle transportiert. Aufgrund von Fütterungsversuchen mit markiertem Methionin und der Identifizierung von Genen mit hoher Homologie zu SAM-abhängigen Methyltransferasen sowie Aminotransferasen wird folgender Biosyntheseweg vorgeschlagen. Das Substrat 5-Guanidino-2-oxo-pentansäure wird durch die Methyltransferase am C3-Atom methyliert und die entstandene 5-Guanidino-3-methyl-2-oxopentansäure anschließend durch die Aminotransferase am C2-Atom aminiert, wodurch MeArg entsteht. Durch die Wiederherstellung der Toxinproduktion in der komplettierten MeArg-negativen Mutante Pss22d.l konnte eindeutig bewiesen werden, dass die Methyltransferase und die Aminotransferase für die Synthese des MeArg notwendig sind. Die Übertragung des Gesamtbiosyntheseclusters in E. coli führte zur heterologen Produktion von MeArg. Das Fehlen des Gens für den Exporter führte zum Ausbleiben einer nachweisbaren Toxinmenge und bestätigt, dass der Exporter aktiv an der Exkretion von MeArg beteiligt ist. Co-Inokulationsexperimente an der Sojabohne mit den Toxi n-n egati ven Mutanten und dem Wildtyp mit dem Pathogen Psg zeigten, dass die Mutanten das Pathogen genauso effektiv wie der Wildtyp unterdrücken. Offensichtlich hat keines der von Pss22d produzierten Toxine, auch nicht das in vitro effizient hemmende MeArg, einen entscheidenden Einfluss auf den in planta Antagonismus. Folglich müssen andere Faktoren in der in planta Wechselwirkung zwischen Pss22d und Psg wirken, die diesen effizienten Antagonismus bedingen. Wahrscheinlich ist die Konkurrenz der Interaktionspartner um Nährstoffe und/oder Raum ein entscheidender Faktor. Pss22d profitiert von den durch Pathogenese bedingte Prozesse freigesetzten Nährstoffen des Pathogens. Der dadurch für Psg verursachte Mangel an Nährstoffen und Raum führt dazu, dass das Pathogen den kritischen Schwellenwert zum Ausbilden von Krankheitssymptomen nicht mehr erreichen kann.
Publications
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- Characterization of an inhibitory strain of Pseudomonas syringae pv. syringae with potential as a biocontrol agent for bacterial blight on soybean. M'B. Fatmi et al. (eds.) Pseudomonas syringae pathovars and related pathogens. Springer Science + Business Media B. V., 103-109, 2008
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