Kartierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Wechselwirkungen mittels Femtosekundenlaser-Quervernetzung und Nanopore-Sequenzierung.

• Antragsteller: Professor Dr. Christoph Russmann
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 538668510

Jede Zelle eines Organismus ist mit der gleichen genetischen Information ausgestattet. Nur ein Teil dieser Informationen wird von den Zellen ständig benötigt, um elementare Funktionen aufrechtzuerhalten. Der größere Teil wird nur unter bestimmten Bedingungen oder in bestimmten Zelltypen benötigt. Die Regulation der Gene erfolgt meist auf der Ebene der Transkription mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren (TF). Die TF-DNA-Bindung wird durch schwache Wasserstoffbrückenbindungen vermittelt, die sich der biochemischen Analyse leicht entziehen. Durch Quervernetzung können diese Bindungen in starke kovalente Bindungen umgewandelt werden. Die chemische Quervernetzung ist effizient, stört aber das Gleichgewicht in der Zelle. Die Quervernetzung mit UV-Lampen ist ineffizient und schädigt die DNA so stark, dass eine spätere molekularbiologische Analyse schwierig ist. Aus diesem Grund wurde die Femtosekunden-Laser-Quervernetzung (FLIX) entwickelt, die eine effiziente und DNA-schonende Quervernetzung der TF mit der DNA ermöglicht. Die Nanoporensequenzierung (NPS) gehört zur dritten Generation der Sequenzierungsverfahren. Innerhalb der Pore nimmt das DNA-Molekül ein Volumen ein, das den Ionenfluss teilweise einschränkt, was als Ionenstromabfall beobachtet wird. Je nach Geometrie, Größe und chemischer Zusammensetzung des Moleküls ändert sich die Stärke des Ionenstroms und die Dauer der Translokation. Das entstehende Rohsignal - „squiggle” genannt - wird durch „basecalling“ in die Nukleotidsequenz übersetzt. Die NPS ermöglicht die Sequenzierung mit hoher Genauigkeit, Leselänge und Durchsatz sowie die Detektion von Basenmodifikationen, z.B. DNA-Methylierung. Im Projekt sollen FLIX und NPS kombiniert werden, um TF-DNA-Interaktionen auf der Ebene einzelner Nukleobasen mit Aminosäuren untersuchen zu können. Damit sollen strukturbiologische Fragestellungen der TF-DNA-Interaktion spezifisch, sensitiv und schnell durch direktes „Auslesen“ mittels NPS beantwortet werden. Zentrales Ziel ist der Nachweis spezifischer Nukleobase-Aminosäure-Komplexe einer TF-DNA-Interaktion. Dazu müssen die bisher unbekannten „squiggles” der Komplexe durch den „basecalling“-Prozess in Nukleotidsequenzen übersetzt werden. Ausgehend von unbestrahlten und bestrahlten doppelsträngigen DNA-Fragmenten über doppelsträngige DNA-Fragmente nach Quervernetzung mit verschiedenen TF werden die „basecalling“-Algorithmen eines Convolutional Neural Network (CNN) trainiert, um die neuen „squiggles” den Nukleobase-Aminosäure-Komplexen und DNA-Schäden zuzuordnen. Durch Variation der Bestrahlungsbedingungen können verschiedene mono- und biphotonische DNA-Schäden erzeugt werden. Die verschiedenen DNA-Modifikationen werden mit biochemischen und physikalischen Methoden nachgewiesen. Die Machbarkeit der Methode wird in vitro und in vivo anhand der DNA-Bindungseigenschaften der TF TBP und NF1, Zellkulturexperimenten und ChIP-Seq gezeigt. Als Goldstandard wird die FLIX-Massenspektroskopie eingesetzt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen