The ubiquitin-like modifier FAT10 in autophagosomal targeting
Final Report Abstract
FAT10 besteht aus zwei Ubiquitin-ähnlichen Domänen und wird nach dessen Induktion durch die entzündungsfödernden Zytokine Interferon(IFN)-γ und Tumor Nekrosefaktor(TNF)-α an hunderte von Proteine konjugiert. FAT10 ist der einzige Ubiquitin-ähnliche Modifikator, der genau wie Ubiquitin konjugierte Proteine zum Abbau durch das Proteasom führt. Wenn das Proteasom überladen oder inhibiert ist, reichern sich Ubiquitin und FAT10 in Aggresomen an, welche aus denaturierten poly-ubiquitylierten oder FAT10ylierten Proteinen bestehen. Poly-ubiquitylierte Proteine können neben dem Abbau durch das Proteasom auch durch den Abbau in Autophagolysosomen degradiert werden. Dieser Abbau wird durch die Bindung von Ubiquitin an den Autophagieadaptor Sequestosom-l/p62 vermittelt, der wiederum an LC3 Proteine an entstehenden Autophagosomen bindet. Zu Beginn dieses Projektes haben wir gefunden, dass p62 nicht nur an poly-Ubiquitinketten sondern auch an FAT10 bindet, und dass p62 kovalent mit FAT10 modifiziert wird. Basierend auf dieser Entdeckung haben wir in unserem Projekt untersucht, ob FAT10 und seine Konjugate in Autophagolysosomen abgebaut werden, und welche Konsequenzen die FAT10ylierung von p62 hat. Ausserdem haben wir untersucht, ob intrazelluläre Bakterien, die zum Teil an deren Oberfläche ubiquityliert und über die Vermittlung von Autophagieadaptoren in Autophagosomen abgebaut werden, auch von FAT10 gebunden werden. Zunächst haben wir die FAT10ylierung von p62 näher charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass sich p62-FAT10 Konjugate unter endogenen Bedingungen in IFN-γ/TNF-α stimulierten Zellen ausbilden und schnell durch das Proteasom abgebaut werden. FAT10 scheint an der Regulation der p62 Mengen in Zellen beteiligt zu sein, da sich p62 nach Zytokin Stimulation zunächst in Zellen anreichert und nach 24 Stunden, wenn die Expression von FAT10 maximal ist, wieder abnimmt. Ausser dass p62 bei der Autophagie verbraucht wird, ist die FAT10ylierung von p62 ein neuer Mechanismus, wie die p62 Menge in Zellen reguliert wird. Eine Herunterregulation von p62 hatte hingegen keinen Einfluss auf den Abbau von FAT10 Konjugalen, welches zeigt, dass p62 als Adapter für die Bindung von FAT10 an das Proteasom nicht erforderlich ist. Eine solche Funktion wird bereits sehr effizient von NUB1L übernommen, wie wir in früheren Arbeiten zeigen konnten. Die FAT10ylierung von p62 ist sowohl auf das Diglyzin Motiv am C-Terminus von FAT10 als auch auf Lysine in p62 angewiesen, was darauf hinweist, dass FAT10 über Isopeptidbindungen an p62 geknüpft ist. Aus dem Molekulargewicht der FAT10-p62 Konjugate lässt sich schliessen, dass p62 mit drei FAT10 Molekülen modifiziert wird. Dabei handelt es sich aber um Modifikationen mehrerer Lysine mit jeweils einem FAT10 Molekül und nicht um poly-FAT10ylierungen, da eine FATIO Variante, in der alle Lysine durch Arginine ersetzt wurden, keine Änderung im Molekulargewicht des p62-FAT10 Konjugats aufwies. Um eine Rolle der Autophagie für den Abbau von FAT10 Konjugalen zu untersuchen, wurden sowohl biochemische als auch fluoreszenzmikroskopischeExperimente durchgeführt. Die Inhibition oder Aktivierung der Autophagie hatte keinen Einfluss auf den Abbau von FAT10. Ausserdem konnte mit einem mCherry-EGFP-FAT10 Fusionsprotein in Zellen im Gegensatz zu einem mCheny-EGFP- 4xUbiquitin Fusionsprotein kein Hinweis auf eine Lokalisierung von FAT10 in ansäuernden Autophagolysosomen gefunden werden. Es sieht also so aus, dass FAT10-Konjugate im Gegensatz zu Ubiquitinkonjugaten ausschliesslich durch das Proteasom abgebaut werden. Die Ubiquitylierung von intrazellulär lebenden Bakterien vermittelt über die Bindung verschiedener Autophagieadaptoren die Zerstörung von Bakterien wie Salmonellen, Listerien oder Chlamydien in sauren Autophagolysosomen. Wir konnten zeigen, dass Salmonella enterica Bakterien in zytokinstimutierten Zellen mit FAT10 überzogen werden, und dass für diese Lokalisierung von FAT10 an der Oberfläche intrazellulärer Salmonellen eine Konjugierung von FAT10 erforderlich ist. Derzeit untersuchen wir, ob auch andere Bakterien in Zellen mit FAT10 überzogen werden, und ob FAT10 einen Beitrag leistet zur intrazellulären Abwehr gegen Bakterien. Da die Enzyme der FAT10 Konjugierung pharmakologisch reguliert werden können, könnten über diesen Weg die Abwehr gegen pathogene Bakterien wie Salmonellen gestärkt werden.
Publications
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