Observation of single transport events through single pore complexes of the nuclear envelope by means of near-field optical microscopy
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das übergeordnete Ziel dieser und der vergangenen Förderperioden war es, mittels optischer Nahfeldmikroskopie (NSOM) erstmals den Transport von Proteinen durch einzelne nukleäre Poren orts- und zeitaufgelöst zu beobachten, um so detaillierte Hinweise hinsichtlich des Transportmechanismus zu gewinnen. Dieses Ziel wurde nun erstmals durch die neue Kombination von NSOM mit Methoden der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) erreicht und es konnten durch Messung an individuellen, funktionell intakten Kernporen kinetische Größen des Transportprozesses am Beispiel des Transportfaktors NTF2 bestimmt werden. Die Analyse der NSOM-FCS Spektren zeigt, dass NTF2 den zentralen Kanal der Pore mittels Brownscher Bewegung durchquert und sich durchschnittlich 3.6 ± 0.5 ms im Kanal aufhält. Dabei diffundiert NTF2 innerhalb einer großen axialen Ausdehnung (L eff = 85 ± 11 nm) mit hoher Mobilität durch den Kanal (scheinbarer Diffusionskoeffizient Dapp =17 ± 3 µm/s). Diese qualitativ und quantitativ sehr konkreten Ergebnisse lassen einen Vergleich mit aktuellen Transportmodellen zu. Die große Diffusionslänge entlang der Achse kann als Hinweis einer Wechselwirkung von NTF2 mit weit aus dem zentralen Bereich hinausragenden FG-Filamenten interpretiert werden und unterstützt so Modelle, die auf einen entsprechenden Mechanismus beruhen (z.B. virtual-gate Modell). Voraussetzung zur Erzielung dieser Ergebnisse war die Entwicklung einer neuen Methode zur passiven Abstandskontrolle der NSOM Sonde an einer weitgehend natürlichen (d.h. unfixierten) Kernmembran. Diese wurde auf der Basis freitragender Membranen über 20 µm große Tröge in einem Fotolack realisiert. Erstmals können so NSOM Bilder hoher optischer Auflösung in einer nicht substratunterstützten, fluoreszenzmarkierten Membran gemessen werden. Da der Transportkanal der Poren in freistehenden Membranbereichen im Vergleich zu den üblichen substratunterstützten Membranen nicht länger verstellt wird, kann der Transport fluoreszenzmarkierter Proteine untersucht werden, indem die NSOM Sonde über eine Pore platziert und die Fluoreszenz markierter Proteine beim Passieren der Pore als Funktion der Zeit beobachtet wird. Das extrem kurzreichweitige evaneszente Feld der NSOM Sonde (10-25 nm) erzeugt einen steilen, exponentiell abfallenden Intensitätsgradienten entlang des Transportkanals, so dass die im Kanal diffundierenden markierten Moleküle starke Fluoreszenzfluktuationen bewirken. Diese Intensitätsfluktuationen wurden mittels Techniken der Korrelationsspektroskopie ausgewertet. Als Ausgangspunkt der anschließenden Analyse diente ein eindimensionales analytisches Modell der Braunschen Bewegung eines Partikels in einem beschränkten Raum, das im Rahmen dieses Projektes entwickelt wurde. Numerische Monte-Carlo-Rechnungen dienten zur Verifikation der daraus resultierenden Ergebnisse und wurden zur Analyse komplexerer Modelle verwendet (variierende Diffusionsgeschwindigkeit im Kanal).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"Transmission of an obliquely incident beam of light through small apertures in a metal film", Appl. Phys. B 84, 49-53 (2006)
E. Bortchagovsky, G. Colas des Francs, D. Molenda, A. Naber, U.C. Fischer
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"On the optimum form of an aperture for a confinement of the optically excited electric near field", J. Microsc. 229, 223-227 (2008)
E. Bortchagovsky, G. Colas des Francs, A. Naber, U. C. Fischer
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"Near-Field Optical Study of Protein Transport Kinetics at a Single Nuclear Pore", Nano Letters 9, 3330-3336 (2009)
M. Herrmann, N. Neuberth, J. Wissler, J. Pérez, D. Gradl, A. Naber
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"Fluorescence correlation spectroscopy of particles in a transport channel illuminated by the evanescent field of a near-field optical aperture", Proc. SPIE, Vol. 7571, 757105 (2010)
A. Naber, J. Wissler, J. Pérez, M. Herrmann, D. Gradl
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"Near-field optical fluorescence correlation spectroscopy", Proc. SPIE, Vol. 7571, 757118 (2010)
J. Pérez, M. Herrmann, D. Gradl, A. Naber
