Strukturelle und proteinbiochemische Charakterisierung des Uhrenproteins Period
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Forschungsvorhabens war, PERIOD Proteine aus Drosophila melanogaster (dPER) und der Maus (mPER1,2,3) mit Hilfe von Röntgenkristallographie strukturell und durch komplementäre biochemische und biophysikalische Methoden funktionell zu charakterisieren. Es ist uns gelungen, Röntgenstrukturen der PAS (PER-ARNT-SIM) Domänen-Bereiche von dPER und den drei Maus PERIOD Homologen mPER1,2 und 3 zu bestimmen (Yildiz et al., 2005; Hennig et al, 2009; Kucera et al, in Vorbereitung). Die dPER Struktur hat nicht nur die in der Literatur beschriebene 29 h per' Mutante mechanistisch erklärt, sondern auch den Entwurf neuer Mutanten für die gezielte Analyse des dPER Homodimers in der Fliegen-Uhr ermöglicht (Landskron et al, 2009). Außerdem konnten wir ein aufgrund unserer dPER Struktur postuliertes Modell, demzufolge dTIM an die ß-Faltblattoberflächen der PAS-A- und PAS-B Domänen von dPER bindet, durch Hefe-2-Hybrid-Experimente mit strukturbasierten Mutationen bestätigen und zeigen, dass die PAS-B Bindung stärker ist als die Bindung an PAS-A. Mit der PAS-B Tripeloberflächenmutante E474R/H492S/R494D können wir den Chronobiologen eine weitere Mutation für die gezielte Analyse der Funktion des dPER-dTIM-Heterodimers in der inneren Uhr der Fliege anbieten. Unsere mPER PAS-Domänenstrukturen haben Homodimere aufgezeigt, welche massgeblich durch jene PAS-B ß-Faltblattoberfläche vermittelt werden, welche bei dPER die Interaktion mit dTIM vermittelt. Weiterhin konnten wir zeigen, dass mPER1 Homodimere (vermutlich aufgrund einer zusätzlichen Dimerisierungskontaktfläche in der PAS-A Domäne) eine 10 mal höhere Affinität haben als mPER2- und mPER3 Homodimere. Man kann davon ausgehen, dass die unterschiedlichen Homodimer Affinitäten die heterodimeren Interaktionen der mPER Homologe mit anderen Uhrenproteinen wie z.B. den Transkriptionsfaktoren Rev-erb und Bmal1 beeinflussen und somit zu den noch wenig verstandenen nicht-redundanten Funktionen der drei mPER Homologe in der Säugetier-Uhr beitragen. Ähnlich wie bei dPER können wir aufgrund unserer in vitro Analysen strukturbasierter mPER-Mutanten Mutationen für eine gezielte Analyse der Funktion bestimmter mPER-Komplexe in der inneren Uhr der Säugetiere anbieten. Abschließend sollte angemerkt werden, dass die Strukturbiologie und Proteinbiochemie/Biophysik bei der Chronobiologie noch sehr in ihren Anfängen steckt. Unsere dPER Struktur war die erste SD-Struktur eines eukaryotischen Uhrenproteins und es existieren außer unseren Daten noch keinerlei quantitative Untersuchungen zu den Proteininteraktionen von Säugetier-Uhrenproteinen. Solche Untersuchungen stellen aber eine wichtige Grundlage für eine gezielte Suche nach Kleinmolekülliganden dar, die durch Modulation der spezifischen Proteininteraktionen in der inneren Uhr diagnostische oder vielleicht längerfristig auch therapeutische Anwendungen z.B. bei der Erleichterung der Schichtarbeit oder des Jetlags finden könnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Crystal Structure and Interactions of the PAS Repeat Region of the Drosophila Clock Protein PERIOD. Mol. Cell, 17(1 ):69-82, 2005
Ö. Yildiz, M. Doi, I. Yujnovsky, L. Cardone, A. Berndt, S. Hennig, S. Schulze, C. Urbanke, P. Sassone-Corsi and E. Wolf
- SRBR (Society of Research on Biological Rhythms) meeting 2006: „Structural and biochemical Characterization of PAS Domain Interactions in Drosophila PERIOD"
- GBM meeting 2007: „Structural and biochemical Characterization of Drosophila and mammalian circadian Clock (PERIOD) Proteins"
- A Role of the PERIOD:PERIOD Homodimer in the Drosophila circadian Clock. PLoS Biology Apr 28;7(4):e3, 2009
J. Landskron, KF. Chen, E. Wolf and R. Stanewsky
- Structural and Functional Analyses of PAS Domain Interactions of the Clock Proteins Drosophila PERIOD and Mouse PERIOD2. PLoS Biology Apr 28;7(4):e94, 2009
S. Hennig, H. Strauss, K. Vanselow, Ö. Yildiz, S. Schulze, J. Arens, A. Kramer and E. Wolf
- SRBR meeting 2010: „PAS Domain Interactions of Drosophila and Mouse PERIOD Proteins"
- Tagung Mikromethoden der Proteinchemie 2010: „Strukturelle Chronobiologie"
