Neue molekularzytogenetische Ansätze zur Untersuchung der Aneuploidisierung in der frühen Karzinogenese des Urothelkarzinoms
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Für die Analyse der Tumorinitiation in der Harnblase wurden histologische Methoden sowie zytogenetische in Kombination mit Immunhistochemie genutzt. Zunächst sollten Zellverbände, die erste Veränderungen aufweisen, die zu einer malignen Entartung führen können, identifiziert werden. Hierzu wurden Vorstadien (Hyperplasien) und frühe Tumorstadien (insbesondere die Dysplasie, weniger das Carcinoma in situ nach WHO Klassifikation 2004) der Harnblase untersucht. Gerade in so frühen Stadien ist zu erwarten, dass die Anzahl genetischer Veränderung noch so gering ist, als dass man jene delektieren könnten, die für die Tumorgenese entscheidend sind. Mit Hilfe des Antikörpers Ki-67 konnten Proliferationsherde im Gewebe dargestellt werden, deren genetische Veränderungen als relevant erachtet werden, da bei nicht-proliferierenden Zellen die Möglichkeit besteht, dass die beobachtete Veränderung nicht mit dem Überleben der Zelle einhergeht. Die Doppelfärbung Ki-67 Immunhistochemie Mehrparamter-Interphase-FISH konnte für die genannten Läsionen und Normalgewebe stabil etabliert werden. Die weitere direkte Kombination vergleichender Genomhybridisierung (CGH) aus den gesamtgenomische DNA einzelner Zellen erschien sinnvoll. Daten der CGH sollten die RSH-Daten ergänzen und bestätigen, d.h. es sollte aufgezeigt werden, ob die Detektion chromosomaler Defekte allein mit klassisch diagnostischen Verfahren wie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (UroVysion) ausreicht. Die Verteilung der genetischen Defekte im Gewebe(-schnitt) sollte weiteren Aufschluss über mögliche tumorigene Hot-spots geben. Diesbezüglich sollten sog. „Aneuploidie- Zell-Cluster" an Gewebeschnitten von Menschen verschiedener Alterstufen identifiziert werden. Zunächst sei festgehalten, dass keine Korrelation zwischen der Altersspezifischen Verteilung und chromosomaler Defekte festgestellt werden konnte (bei begrenzter Fallzahl). Unter den beobachteten Aneuploidien in Hyper- und Dysplasien traten vermehrt Monosemien und Trisomien der UroVysion- Centromersonden sowie Monosomien der Lokus-spezifischen Sonde (p16) auf. Es wird deutlich, dass die bisher weitgehend als gutartig bewerteten Hyperplasien schon für das Harnblasenkarzinom typische genetische Veränderungen zeigen können. Dysplsasien, die in der neuen WHO-Klassifkation neu definiert worden sind, bedürfen einer neuen Bewertung. Die Detektion von Nullisomien (Deletion beider Allele) der Lokus-spezifischen Sonde und vereinzelter Tetrasomien (aller Sonden oder auch nur einzelner) stellen einen Bezug zum Tumorvorstadium her, obwohl das Spektrum an Veränderungen sowohl als Vorläufer eines papillären als auch eines soliden Tumors gelten kann. Diese Daten sind die ersten genetischen Daten zur Dysplasie nach der neuen WHO-Klassifikation, zu der es nur wenige Fälle gibt, da die Definition des Carcinoma in situ viele der früher als Dysplasie bezeichneten Läsionen einschließt. Carcinomata in situ zeigten erwartungsgemäß einen höheren Grad an Aneuploidie/Aneusomie (Pentasomien) in unseren Untersuchungen. Einzelzell-CGH- Ergebnisse zeigten, dass gerade proliferierende Zellen im Vergleich zu den in der GO-phase sich befindenden Zellen weniger Aneusomien der Chromosomen besitzen, jedoch vor allem bereits Deletionen am Chromosom 9 aufweisen. Viele Aneusomien der Chromosomen sind letal. Eine Ausnahme bildet der 9p-Verlust, da hierdurch ein Ausfall der lNK4-Gruppe erfolgt und somit der Cyclin-CDK-Komplex am G1/S-Checkpoint nicht inhibiert werden kann, demnach eine gesteigerte Proliferation vorliegt. Weitere eigene Daten zeigen, dass auch die sehr frühe und interessante FGFR3 Mutation, die die Prognose papillärer Tumoren bestimmt, erst nach der Chromosom 9 Mutation im Urothel erfolgt. Die Instabilität des normalen Urothels bei Tumorpatienten wird durch die STK15- Amplifikation deutlich, wie erste unserer Daten zeigten, die jetzt einer prospektiven multizentrischen Studie zur klinischen Validierung unterliegen. Die aufwendige Arbeit an relativ seltenen frühen Tumorstadien hat uns auf Einzelebene wichtige Einsichten in das Harnblasenkarzinom gegeben, die der neuen an genetischen Daten orientierten Klassifikation eine weitere Basis geben.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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JB Geigl, S. Langer, S. Barwisch, K. Pfleghaar, G. Lederer, MR Speicher
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Schwarz, S.; Rechenmacher, M.; Lottner,C.; Brockhoff, G.; Hartmann, A.; Langer, S.; Knuechel, R.
- Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res 2004; 12(4): 337- 43
S. Thalhammer, S. Langer, MR Speicher, WM Heckl, JB Geigl
- Genomic profiling of viable and proliferative micrometastatic cells from early-stage breast cancer patients. Clin Cancer Res 2004; 10 (10): 3457-64
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- Multicolor chromosome painting in diagnostic and research applications.Chromosome Res. 2004; 12 (1); 15-23
S. Langer, J. Kraus, I. Jentsch, MR Speicher
- "Double staining of Fluorescence-in-situ-hybridisation-(UroVysion®) and Ki-67 Immunohistochemistry for detection of genetic aberrations in precancerous lesions of the bladder." 15th Annual Meeting of the German Society for Cytometry 2005, Leipzig
S. Koufou, S. Langer, K. Lindemann-Docter, M.R. Speicher and R. Knuechel
- Live cell catapulting and recultivation does not change the karyotype of HCT116 tumor cells. Cancer Genet. Cytogenet. 2005; 161 (2): 174-7
S. Langer, JB Geigl, S. Ehnle, R. Gangnus, MR Speicher
- Sequential application of interphase-FISH and CGH to single cells. Lab Invest 2005; 85 (4): 582- 92
S. Langer, JB. Geigl, R. Gangnus, MR. Speicher
- "Insight in chromosomal aberrations and their proliferative advantage for precancerous urothelial lesions." CNIO Meeting: Bladder Cancer: Searching targets and biomarkers using genomic and proteomic approaches, 5-6 Oktober 2006, Madrid, Spanien
S. Koufou, S. Langer, K. Lindemann-Docter, M. Speicher and R. Knüchel
- "Single-cell multi-analysis (FISH, IHC, single-cell CGH) of early flat urothelial lesions." 3rd Münster Conference on Single cell analysis 2006, Münster
S. Koufou, S. Langer, M.R. Speicher and R. Knuechel
- Chromsome 9 deletions are more frequent than FGFR3 mutations in flat urothelial hyperplasias of the bladder. Int J Cancer. 119:1112-5, 2006
Van Oers, J.M.; Adam, C.; Denzinger, S.; Stoehr, R.; Bertz, S.; Zaak, D.; Stief, C.; Hofstaedter, F.; Zwarthoff, E.G.; van der Kwast, T.H., Knuechel, R.; Hartmann, A.
- „Untersuchung genetischer Aberrationen in Präkanzerosen der Harnblase mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisation und Ki-67 Immunhistochemie Doppelfärbung, sowie Comparative Genomic Hybridisation." 90. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pathologie 19.-21. April 2006, Berlin
S. Koufou, S. Langer, K. Lindemann-Docter, M.R. Speicher and R. Knuechel
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Schwarz S, Rechenmacher M, Filbeck T, Knuechel R, Blaszyk H, Hartmann A, Brockhoff G
