Struktur und Dynamik eines Faltungsintermediates der C-terminalen Domäne eines Spidroins

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Ute Hellmich; Privatdozent Dr. Hannes Neuweiler
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 540980616

Webspinnen verknüpfen Fibroine, sogenannte Spidroine, zu Seidenfäden von außergewöhnlicher Belastbarkeit. Die Aminosäuresequenzen von Spidroinen sind das Ergebnis von hunderten Millionen Jahren Evolution. Sie weisen eine einzigartige Architektur auf mit Unterdomänen spezifischer Strukturen und Funktionen. Der größte, zentrale Sequenzbereich besteht aus sich wiederholenden Peptid-Motiven. Endständig befinden sich die hochkonservierten, globulär gefalteten N- und C-terminalen Domänen (NTD und CTD), die Homodimere ausbilden. Die terminalen Domänen vermitteln Löslichkeit und Konnektivität von Spidroinen und induzieren Struktur- und Phasenübergänge mittels ausgeklügelter Mechanismen, die durch chemische Stimuli im Spinnkanal des Tiers ausgelöst werden. Domänenwechsel ist ein wichtiger Mechanismus in der Oligomerisierung von Proteinen und ein Markenzeichen von Spidroin CTDs, die als Dimere ihre C-terminalen Helices austauschen. Erst kürzlich haben wir berichtet, dass der Domänenwechsel die partielle Entfaltung von CTDs in der distalen, sauren Region des Spinnkanals erleichtert und somit möglicherweise einen wichtigen Beitrag zur Seidensynthese liefert. Jedoch sind sowohl der Mechanismus der Entstehung als auch die Struktur der partiell gefalteten CTD unverstanden. Mechanismen der Fehlfaltung menschlicher Proteine, die zur Ausbildung beta-Faltblatt-reicher Proteinaggregate und neurodegenerativer Erkrankungen führen, und Mechanismen der Umfaltung von Seidenproteinen, die zur Ausbildung beta-Faltblatt-reicher Fasern in der Spinnenseidensynthese führen, beinhalten den Domänenwechsel teilentfalteter Proteine und weisen somit auffällige Ähnlichkeiten auf. In Vorarbeiten haben wir beobachtet, dass eine Spidroin CTD der Schwarzen Witwe Latrodectus hesperus bei pH 5, dem pH-Wert am Ende des Spinnkanals, durch kalte Denaturierung ein partiell entfaltetes Intermediat bildet. Kalte Denaturierung von Proteinen wird verursacht durch die Temperaturabhängigkeit des hydrophoben Effekts. Sie ist nur sehr selten unter physiologischen Bedingungen und bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes beobachtbar. Im vorliegenden Projekt kombinieren wir NMR-Spektroskopie mit Zirkulardichroismus und photoinduzierter Elektronentransfer-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (PET-FCS) um die Struktur und den Mechanismus der Entstehung des Faltungsintermediats einer Spidroin CTD von L. hesperus zu untersuchen. Wir führen, neben Mutagenese- und Sequenzverkürzungsexperimenten, thermische und chemische Denaturierungsexperimente bei verschiedenen pH-Werten durch, die die unterschiedlichen pH-Werte innerhalb des Spinnkanals abbilden. Von den Ergebnissen unseres Projekts erwarten wir elementare Einblicke in die Reaktionspfade der Faltung und kalten Denaturierung eines Spinnenseidenproteins, sowie neue Erkenntnisse zur Rolle des Domänenwechsels bei Struktur- und Phasenübergänge von Proteinen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen