Struktur-Funktionsbeziehungen der Enzyme des phz-Operons aus Pseudomonas: die Biosynthese von Phenazin-Antibiotika
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Phenazine sind stickstoffhaltige aromatische Verbindungen, die von vielen Bakterien synthetisiert und in die Umwelt abgegeben werden. Sie sind redoxaktiv und können mit vielen physiologisch bedeutsamen Molekülen Elektronen austauschen. So aktivieren sie Sauerstoff zu toxischen reaktiven Sauerstoffspezies, was ihre gewebeschädigende Wirkung mit einhergehenden Entzündungssymptomen bei Infektionskrankheiten erklärt. Gleichzeitig spielen Phenazine auch im Energiestoffwechsel der Phenazinproduzenten eine Rolle, weil sie unter anaeroben Bindungen NADH zu NAD+ reoxidieren und so zur Aufrechterhaltung von Glykolyseprozessen beitragen. Die Phenazinbiosynthese ist somit ein interessanter Angriffspunkt für neue Antiinfektiva. Phenazine entstehen aus Chorismat in einem konservierten Biosyntheseweg, der von fünf Phz-Enzymen katalysiert wird. Zu Beginn des Projekts war klar, dass Chorismat zunächst zu 2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) umgewandelt wird, welches dann durch PhzD in trans-2,3-Dihydro-3-hydroxyanthranilat (DHHA) und Pyruvat gespalten wird. Im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchungen konnte durch eine Kombination von proteinkristallografischen und biochemischen Experimenten gezeigt werden, dass DHHA anschließend durch eine von PhzF katalysierte [1,5]-prototrope Verschiebung in ein Aminoketon umgelagert wird, dass anschließend durch Kondensation mit einem identischen Ketonmolekül zu einem trizyklischen Phenazinvorläufer verschmilzt. Diese Reaktion kann spontan ablaufen, wird aber durch PhzB stark beschleunigt und ihrer Effizienz verbessert. Pseudomonaden produzieren neben PhzB auch noch das zu 80% identische PhzA, welches für sich nicht enzymatisch aktiv ist, durch Heterodimerisierung mit PhzB jedoch zu einer verstärkten Phenazinerzeugung führen kann. Das Produkt von PhzB kann durch unkatalysierte oxidative Decarboxylierung partiell aromatisieren oder durch PhzG flavinabhängig weiter oxidiert werden. Dies erklärt, warum einige Stämme die nichtsymmetrische Phenazin-1-Carbonsäure (PCA) als Vorstufe für stammspezifische Phenazinderivate erzeugen, während in anderen Spezies Phenazin-1,6-Dicarbonsäure (PDC) als Intermediat entsteht. Die eigentlichen Produkte der Phenazinbiosynthese sind PCA und PDC in ihrer reduzierten und nicht in der Literatur gefundenen durcharomatisierten Form. Da die aus DHHA erzeugten Intermediate der Phenazinbiosynthese nicht stabil sind, mussten analytische Techniken wie HPLC-gekoppelte Massenspektrometrie sowie Kernresonanzspektroskopie eingesetzt werden. Außerdem wurden für Strukturuntersuchungen an PhzB Analoga der trizyklischen Intermediate synthetisiert. Durch strukturgesteuertes Design konnten diese Analoga in ihrer Affinität bis auf 51 nM verbessert werden, außerdem wurde ein chiraler Ligand identifiziert, dessen Enantiomere PhzB gleichzeitig in einem neuartigen Interaktionstyp binden. Diese Moleküle werden derzeit zu Inhibitoren der Phenazinbiosynthese in Zellkulturexperimenten weiterentwickelt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2004) Structure and function of the phenazine biosynthesis protein PhzF from Pseudomonas fluorescens. Proc Natl Acad Sci USA 101:16431-6
Blankenfeldt W, Kuzin AP, Skarina T, Korniyenko Y, Tong L, Bayer P, Janning P, Thomashow LS, Mavrodi DV
- (2006) Phenazine Compounds in Fluorescent Pseudomonas spp. Annu Rev Phytochemistry 44:417-45
Mavrodi DV, Blankenfeldt W, Thomashow LS
- (2008) PhzA/B catalyzes formation of the tricyclic scaffold in phenazine biosynthesis. J Am Chem Soc 130:17053-61
Ahuja EG, Janning P, Mentel M, Graebsch A, Breinbauer R, Hiller W, Costisella B, Thomashow LS, Mavrodi DV, Blankenfeldt W
- (2009) Of Two Make One: The Biosynthesis of Phenazines. ChemBiochem 10:2295-304
Mentel M, Ahuja EG, Mavrodi CV, Breinbauer R, Thomshow LS, Blankenfeldt W
- (2009) The Active Site of an Enzyme Can Host Both Enantiomers of a Racemic Ligand Simultaneously. Angew Chem Int Ed Engl 48: 9084-7
Mentel M, Blankenfeldt W, Breinbauer R
- (2010) Diversity and Evolution of the Phenazine Biosynthesis Pathway. Appl Environ Microbiol 76:866-79
Mavrodi DV, Peever TL, Mavrodi OV, Parejko JA, Raaijmakers JM, Lemanceau P, Mazurier S, Heide L, Blankenfeldt W, Weller DM, Thomashow LS
