Molecular characterization of the centrosome/nucleus-connector
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Verbindung des Centrosoms mit dem Zellkern ist von herausragender Bedeutung für die Mitose, die Kernpositionierung und die gerichtete Zellmigration. Die Centrosom/Kern- Verbindungsstruktur besteht aus einem Proteinkomplex, der sich aus Kernhüllenproteinen der ubiquitären SUN-Familie gemeinsam mit mehreren direkten und indirekten Bindungspartnern dieser Proteine zusammensetzt. Die SUN-Proteine befinden sich normalerweise überwiegend in der inneren Kernhüllenmembran und ragen mit der SUN- Domäne in den perinukleären Raum. Dort binden sie Membranproteine der äußeren Kernhülle. Bei allen bisher bekannten SUN-Interaktoren der äußeren Kernhülle wird diese Interaktion über eine sogenannte KASH-Domäne vermittelt. Den Komplex aus SUN- und KASH-Domänen-Protein bezeichnet man auch als LINC-Komplex. Nach wie vor lässt sich bei der Betrachtung verschiedener Spezies kein einheitliches Bild welches KASH-Domänen Protein hierbei direkt oder indirekt mit dem Centrosom interagiert. Bei Dictyostelium brachte das Genomprojekt keine eindeutigen KASH-Domäne-Proteine hervor. Wir konnten im Rahmen dieses DFG-Projekts die Lokalisation und Funktion von Sun1 bei Dictyostelium aufklären und eine Reihe weiterer Proteine charakterisieren, die an der Centrosom/Zellkerninteration beteiligt sind. Durch Immuno-EM konnten wir erstmals zeigen, dass das auch in einer anderen Arbeitsgruppe untersuchte Sun1 Protein nicht nur in der inneren Kernhüllenmembran sondern gleichermaßen auch in der äußeren Kernhüllenmembran vorkommt. Wir konnten auch erstmals das dynamische Verhalten des kompletten GFP-markierten Dictyostelium Sun1 Proteins in lebenden Zellen untersuchen und zeigen, dass Sun1 in der Kernhülle in zwei Populationen auftritt, einer kaum mobilen pericentrosomalen Fraktion und einer hochmobilen Fraktion außerhalb des pericentrosmalen Bereichs. Über Mutanten konnten wir zeigen, dass Sun1 nicht nur für die Centrosom/Zellkerninteraktion essentiell ist, sondern auch für das Clustering der Centromere in der pericentrosomalen Region und dem Erhalt der Ploidie notwendig ist. Unsere Arbeiten führten zum einem Modell, in der die wenig mobile pericentrosomale Sun1 Fraktion bei der Ausbildung einer stabilen Verbindung zwischen Kernhülle und Centrosom beteiligt ist, während die über die Kernhülle verteilte mobile Fraktion andere Funktionen erfüllt, z.B. in Interaktionen mit der nuklären Lamina oder dem Chromatin involviert ist. Hinsichtlich möglicher Bindungspartner von Sun1 sollte ein mögliches Orthologes zum indirekten Sun1-Interaktor Bbp1 aus S. cerevisiae untersucht werden. Das Dictyostelium Protein wurde eingehend charakterisiert, es stellte sich dabei allerdings als Centromerprotein heraus, das nicht an der Centrosom/Zellkern-Interaktion beteiligt ist. Inzwischen ist es durch unsere Arbeit der beliebteste Centromermarker bei Dictyostelium, da es als einziger bekannter Centromermarker permanent, also auch in der Interphase dort lokalisiert. Es gelang uns im Rahmen des Antrags leider nicht direkte Bindungspartner von Sun1 nachzuweisen, allerdings konnten wir mit CP148, Centrin B, Kif9 und NE81 z.T. im Rahmen von Kollaborationen vier weitere Proteine charakterisieren, die bei der Centrosom/Zellkern-Interaktion beteiligt sind. CP48 ist ein Gerüstprotein der centrosomalen Corona, das das Assembly der Interphase- Mikrotubuli-Nukleationskomplexe ermöglicht. Darüber hinaus kommt es bei Depletion des Proteins durch RNAi zu einer Entkopplung des Centrosoms vom Zellkern. Kif9 ist ein Protein der äußeren Kernhülle, das mit Sun zumindest indirekt interagiert und offensichtlich über seine Mikrotubuli-Depolymerase-Eigenschaft das Centrosom über die von ihm ausgehenden Mikrotubuli zum Kern heran zieht. Centrin B und NE81 sind Proteine des Zellkerns, bei deren Knockout es ebenfalls zum Verlust der Centrosom/Zellkern-Interaktion kommt. Während die genaue Rolle von Centrin B bei dieser Funktion unklar ist, konnten wir nachweisen, dass es sich bei NE81 um das erste Lamin-artige Protein in einem niederen Eukaryoten handelt und es vermutlich die nukleäre Lamina ausbildet. Die Charakterisierung von NE81 erfolgte in einem unabhängigen DFG-Projekt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009) Dictyostelium discoideum CenB is a bona fide centrin essential for nuclear architecture and centrosome stability. Eukaryot. Cell 8(8):1106-1117
Mana-Capelli S, Gräf R, & Larochelle DA
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(2009) Dictyostelium Sun1 is a dynamic membrane protein of both nuclear membranes and required for centrosomal association with clustered centromeres. Eur. J. Cell Biol. 88(11):621-638
Schulz I, Baumann O, Samereier M, Zoglmeier C, & Gräf R
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(2009) Identification and cell cycle-dependent localization of nine novel, genuine centrosomal components in Dictyostelium discoideum. Cell Motil. Cytoskeleton 66(11):915-928
Schulz I, et al.
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(2012) Characterization of NE81, the first lamin-like nucleoskeleton protein in a unicellular organism. Mol. Biol. Cell 23:360-370
Krüger A, et al.
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(2012) Functional characterization of CP148, a novel key component for centrosome integrity in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci 69(11):1875-1888
Kuhnert O, Baumann O, Meyer I, & Gräf R
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(2013) A kinesinmediated mechanism that couples centrosomes to nuclei. Cell Mol Life Sci. 70:1285-1296
Tikhonenko I, Magidson V, Gräf R, Khodjakov A, & Koonce MP
