Untersuchung der Assemblierung und Subtypcharakterisierung von Liganden-gesteuerten Ionenkanälen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel der Arbeit war die Untersuchung der Struktur und Assemblierung Ligandengesteuerter ionenkanäle. Dazu wurden im Falle des nAChR mittels funktionetler und Experimente an Oozyten-exprimierten nAChRs die Struktur-Wirkungsbeziehungen von a-Conotoxinen untersucht, um langfristig selektive Liganden zur Subtypcharakterisierung dieser Rezeptoren zu entwickeln. Im Falle des P2XR, über dessen Struktur bisher nur wenig bekannt ist, wurde mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden die Lokalisation der Ligandenbindungsstelle und die Assemblierung verschiedener Untereinheiten untersucht. Struktur-Wirkungsbeziehungen von a-Conotoxinen In Zusammenarbeit mit Dr. Lewis in Brisbane konnten wir im Rahmen des Projektes neuartige a-Conotoxine und eine bisher nicht beschriebene Klasse von Peptiden mit Aktivität an nAChRs identifizieren und charakterisieren (1, 7). Durch Mutagenese basierend auf Computer-"Docking"-Studien (2) konnten wir außerdem Aminosäuren in der a3- und ß2-Untereinheit des nAChR identifizieren, die direkt mit Aminosäureseitenketten in verschiedenen a-Conotoxinen interagieren (6) und durch Vergleich ihrer Aktivität an verschiedenen nAChR-Subtypen erste Hinweise auf die strukturelle Basis der Subtypselektivität bestimmter Conotoxine erhalten (10). Unsere Ergebnisse zur Bindung der a-Conotoxine wurden durch eine unabhängige Kristallisationsstudie (Celie et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2005) bestätigt und zeigten erstmalig die Eignung des auf dem Acetylcholinbindenden Protein beruhenden Homologiemodells zur Vorhersage von nAChR-Conotoxin-Interaktionen und die funktionetlen Konsequenzen der Mutationen im vollständigen Rezeptor. Diese Informationen sind Voraussetzung für das Design Subtypselektiver Peptide. Untersuchungen der Struktur und Assemblierung des P2X-Rezeptors Durch Anwendung nativer Gelelektrophorese in Kombination mit "Western-Blotting" konnten wir erstmalig einen heteromeren P2X1/4-Rezeptor nachweisen und diesen auch funktionell charakterisieren (4). Mittels einer Disulfid-"Cross-linking"-Strategie gelang es uns außerdem funktionell und biochemisch nachzuweisen, dass die Aminosäuren K68 und F291, welche in der P2X-Primärstruktur weit voneinander entfernt liegen, im funktioneilen Rezeptor räumlich so eng benachbart sind, dass es bei ihrem Austausch durch Cysteine zu einer spontanen und spezifischen Disulfidbrückenbildung zwischen benachbarten P2XrUntereinheiten kommt (8). Diese D is u If id brücke verhindert die Aktivierung durch ATP und kann durch DTT reduziert werden, wodurch die Rezeptoren wieder aktivierbar werden. Die Reoxidation kann durch ATP spezifisch verhindert werden. In Abwesenheit von detaillierten Strukturinformationen über diese Rezeptorklasse konnten wir somit erstmalig einen direkten Hinweis auf die räumliche Anordnung dieser Aminosäuren erhalten und die ATP-Bindungsstelle zwischen benachbarten Rezeptor-Untereinheiten, ähnlich wie beim nikotinischen Acetylcholinrezeptor, lokalisieren. Weiterhin konnten wir diese Methode zur Untersuchung heteromerer P2X-i/2-Rezetoren anwenden. In mehreren Kooperationen haben wir zur Bestimmung der Assemblierung weiterer Membranproteine beigetragen (3, 5, 9, 11)
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Dutertre, S.*, Ulens, C.*, Büttner, R., van Elk, R., Fish, A., Hopping, G., Kendel, Y., Schroeder, C., Alewood, P., Nicke, A., Smit, A. B., Sixma, T. K., and Lewis, R. Discovery, SAR and co-crystal structure of a high affinity neuronal nAChR ligand using an AChBP screening assay. EMBO J. 22, 3858-3867 (2007)
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Loughnan, M., Nicke, A., Jones, A., Schroeder, C. L, Nevin, S. T., Adams, D. J., Alewood, P. F., and Lewis, R. J. Identification of a novel class of nicotinic receptor antagonists: dimeric conotoxins VxXIIA, VxXllB, and VxXMCfrom Conus vexillum. J. Biol. Chem. 281, 24745-55 (2006)
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Madry, C., Mesic, l., Bartholomäus, l., Nicke, A., Betz, H., and Laube, B. Principal role of NR3 subunits in NR1/NR3 excitatory glycine receptor function Biochem. Biophys. Res. Commun. 354,102-108 (2007)
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Marquez-Klaka, BM Rettinger, J., Bhargava, Y., Eisele, T. and Nicke, A. Identification of an inter-subunit cross-link between substituted cysteine residues located in the putative ATP binding site of the P2Xi receptor J. Neurosci. 27, 1456-1466 (2007)
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Nicke, A., and King B. F. Heteromerization of P2X receptors In "Biological and Biophysical Aspects of Ligand-Gated Ion Channel Receptor Super-families" edited by Hugo R. Arias. Research Signpost. Trivandrum, India, 383- 417(2006)
