Kombinierte strukturelle und biochemische Untersuchungen der dysferlinabhängigen Mechanismen zur Membranreparatur

• Antragsteller: Dr. Constantin Cretu, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 542658629

Die C2-Domänen-Protein Dysferlin ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität der Muskelzellmembran, und Verlust-von-Funktion rezessive Mutationen im großen Ferlin wurden mit Muskeldystrophien und anderen komplexen menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Trotz zahlreicher Studien wissen wir immer noch sehr wenig darüber, wie Dysferlin (und die verwandten Ferline) als Haupt-Ca2+-Sensor des Reparaturwegs fungiert, insbesondere als Teil von multi-subunit Reparaturkomplexen, um die verletzten Membranen effizient zu verschließen. Darüber hinaus sind wir trotz gemeldeter Strukturen von einzelnen Untereinheiten oder Domänen begrenzt in unserem Verständnis, wie die membrangebundenen, höher geordneten Komplexe von Dysferlin in 3D organisiert sind. Um letztendlich ein detailliertes molekulares Modell von Dysferlin in seinem aktiven Zustand zu erhalten, werde ich einen bottom-up experimentellen Ansatz verfolgen, der modernste hochauflösende Bildgebungstechniken und strukturelle Biologiemethoden kombiniert (wie Einzelpartikel-Cryo-EM, Cryo-ET und Nanoskopie), gepaart mit sorgfältigen in vitro Untersuchungen unter Verwendung von Modellmembransystemen. In meinem ersten spezifischen Ziel werde ich, aufbauend auf meiner kürzlich erstellten ersten Cryo-EM-Struktur eines menschlichen Ferlins, meine Bemühungen darauf konzentrieren, vollständige, hochauflösende Strukturmodelle von Dysferlin in seinen aktiven, membrangebundenen Zuständen zu erhalten. Dies umfasst Komplexe mit den endosomalen SNAREs STX4-SNAP-23 und dem Membranreparaturfaktor MG53, sowie die Rekonstitution in Ersatzlipidmembranen (Liposomen und Nanodiscs). Gleichzeitig werde ich einen multidisziplinären, hypothesengetriebenen Ansatz anwenden, um in vitro systematisch die ferlinabhängige Membranbindung und Fusionsmechanismen zu rekapitulieren und zu charakterisieren, unter Verwendung von rekombinant exprimierten Reparaturfaktoren, strukturgeleiteten Domänenmutanten und liposomenbasierten Assays. Schließlich werden wir, basierend auf den jüngsten Fortschritten in der hochauflösenden Lichtmikroskopie, als Teil einer kollaborativen Anstrengung versuchen, das menschliche Dysferlin in der komplexen zellulären Umgebung von ventrikulären Kardiomyozyten zu erfassen, nachdem eine membranschädigende Laserinduktion stattgefunden hat, als Proof-of-Concept für zukünftige In-situ-Cryo-Elektronentomographie-Untersuchungen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen