Die Bedeutung der Chromatinstruktur für die DNA Replikation am Beispiel des latenten Origins des Epstein-Barr Virus, oriP
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Selektion und das Aktivierung von Replikationsursprüngen in der G1-Phase des Zellzykles is möglicherweise von dynamischen epigenetischen Veränderungen und der Mobilisierung von Nukleosomen begleitet. Der latente Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus (oriP) ist ein geeignetes und gut definiertes Modellsystem, um diese regulierten Modifikationen zu studieren. Wir haben im Rahmen dieses DFGProjektes nachgewisen, dass oriP von positionierten Nukleosomen flankiert ist, die während der G1-Phase von einem SNF2h-enthaltenden Chromatinremodelingkomplex mobilisiert werden. Bemerkenswerterweise nahm die Ancetylierung von Histon H3 während der G1-Phase ab, eine Aktivität die durch die Histonacetylasen HDAC1 und HDAC2 vermittelt wird. Beide Prozesse sind für die Aktivierung von oriP essentiell. Die Aktivität von oriP wird durch ein einziges virales Protein gesteuert, EBNA1. EBNA1 fungiert als Rekrutierungsfaktor für die zellulären Initiationsfaktoren. Aufbauend auf publizierte Daten konnten wir zeigen, dass EBNA1 die Funktionen eines zellulären Proteins nachahmt. Der Chromatinfaktor HMGAla besitzt Homologien mit EBNA1 und kann die Tranaktivierungsdomäne von EBNA1 in bezug auf DNA Replikation und den Plasmidstatus ersetzen. Wir haben in der Folge untersucht, ob HMGAla auch für die zelluläre Replikation eine Bedeutung besitzt. Diese Hypothese wird durch unseren initialen Experimente bestätigt und eröffnet eine neue Perspektive zur Regulation und Definition humaner Replikationursprünge. Einer der Expertisen unseres Laboratoriums ist die Entwicklung extrachromosomaler replikationskompetenter Vektoren. Im Rahmen des gefördeten Projektes haben wir einen zweistufigen 'origin-trapping aasay1 entwickelt, der zur Identifizierung neuer humaner Replikationsursprünge geführt hat. Überraschenderweise konnten wir mit Hilfe eines leicht modifizierten ChlP-Protokolls nachweisen, dass der gesamte ORC an humanen Replikationsursprüngen zellzyklusabhängig gebunden ist. Der modulare Aufbau oriP und die Funktionalität der HMGA1a:EBNA1-Hybridproteine hat in uns die Idee reifen lassen, ein replikationskomptetentes Ptasmidsystem zu entwerfen, das durch Verwendung des Tetrayzikltnrepressors / Tetrazyklinopreratorsystems konditional regulierbar ist. Dies wurde nach mehrjähriger Entwicklungsarbeit zur Publikationsreife gebracht und es erlaubt es uns nun systematisch, Replikations- und Plasmiderhaltungs unabhängig voneinander zu studieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Gerhardt, J., Jafar, S., Spindler, M.P., Ott, E. and Schepers, A. (2006) Identification of new human origins of DMA replication by an origin-trapping assay. Mol Cell Biol, 26, 7731-46.
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Thomae, A., Pich, D., Spindler, M.P., Berens, C., Hammerschmidt, W. and Schepers, A. (2008) Interaction between HMGAIa and ORC creates site-specific origins. Proc Natl Acad Sei USA, 105, 1692-7.
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Zhou, J., Chau, C.M., Deng, Z., Shiekhattar, R., Spindler, M.P., Schepers, A. and Lieberman, P.M. (2005) Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DMA replication. EMBO J, 24, 1406-17.
