Erkennung und Prozessierung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern durch den ß-Glucanelicitorrezeptor der Sojabohne
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das ß-Glucanbindeprotein (GBP), ein vermutlich essentieller Bestandteil des ß-Glucanrezeptors der Sojabohne, hat zwei Funktionen: zum einen stellt es die hochaffine Bindestelle für den ß-Glucanelicitor dar, zum anderen ist es enzymatisch aktiv. Zur Rekonstitution einer rekombinanten Bindestelle in einem heterologen System wurden zwei Wirtsorganismen untersucht, das Moos Physcomitrella patens und die höhere Pflanze Arabidopsis thaliana. P. patens verfügt sehr wahrscheinlich über ein einziges Gen, das für ein Protein mit Homologie zum GBP der Sojabohne codiert. Sowohl das Gen als auch die cDNA konnten als Grundlage für die Herstellung von Konstrukten für die homologe Rekombination kloniert werden. Die Transformation mit Disruptionskonstrukten, die zum Austausch des endogenen mit dem Gen aus Sojabohne geführt hätte, konnte aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt werden. Die Transformation von A. thaliana mit verschiedenen Versionen des Gens für das GBP aus der Sojabohne führte zur Bildung des Proteins, was immunologisch nachgewiesen werden konnte. Das rekombinante Protein zeigte zwar ß-Glucanaseaktivität, eine hochaffine Bindestelle für den radioaktiv markierten Hepta-ß-Glucosidliganden konnte allerdings nicht rekonstituiert werden, was auf einer nicht geeigneten Proteomembranumgebung beruhen könnte. Aufgrund struktureller Übereinstimmungen wurde das GBP gemeinsam mit vermuteten Glucanasen aus Pilzen als Glykosylhydroläse-Familie 81 klassifiziert. Wir konnten mit dem GBP aus der Sojabohne als Prototyp die enzymatischen Charakteristika dieser Familie eingehend beschreiben. Die Grundlage dafür war die Optimierung des Verfahrens zur Herstellung von rekombinanten GBP-Proteinvarianten in Hefe, zum einen durch die dosierte Anwendung von Detergenzien während des Zellaufschlusses und der Vorreinigung durch eine fraktionierte Salzfällung, zum anderen durch die Einführung des Calmodulinbindepeptids, das es erlaubte, das rekombinante Protein durch Affinitätschromatografie schonend rein darzustellen. Drei für die Katalyse notwendige Aminosäuren des aktiven Zentrums (Asp418, Glu494, Glu498) wurden definiert, was die Vorhersage der Lokalisierung des enzymatischen Moduls im C-terminalen Bereich bestätigte. Nur Glucane, die durch ß-1,3- und nicht durch ß-1,6-glykosidische Bindungen miteinander verknüpft sind, wurden durch das GBP hydrolysiert. Die Mindest-Kettenlänge für hydrolysierbare lineare ß-1,3-Glucane betrug vier Glucosereste. Um den Modus der Hydrolyse festzulegen, wurden zwei Methoden angewandt: zum einen wurden die Spaltprodukte der Hydrolyse von Laminarioligosacchariden mittels "Polysaccharide Analysis using Carbohydrate Gel Electrophoresis" sichtbar gemacht, zum anderen wurde die Hydrolyse eines mit FRET-Sonden bifunktionalisierten Laminaritetramers durch die Beobachtung des Fluoreszenzresonanz-Energie-Transfers verfolgt. Beide Ansätze zeigten eindeutig, dass das GBP ausschließlich im Inneren einer Glucankette angreifen kann, es handelt sich also um eine Endo-Glucanase. Schließlich wurde durch die Beobachtung der Protonen-Kernresonanz während der Hydrolyse von Laminarin eindeutig festgelegt, dass die Enzyme der Familie 81 ß-glykosidische Bindungen unter Invertierung der Konfiguration am anomeren C-Atom hydrolysieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2005) Catalytic properties of the bifunctional soybean ß-glucan-binding protein, a member of family 81 glycoside hydrolases. FEBS Letters 579, 6647-6652
Judith Fliegmann, Emilie Montel, Alma Djuliċ, Sylvain Cottaz, Hugues Driguez, Jürgen Ebel
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»Convergent evolution of plant and animal pattern recognition receptors specific for ß-glucans«. 12th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, Merida, Mexiko, Dezember 2005
Judith Fliegmann
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»Convergent evolution of plant and animal pattern recognition receptors specific for ßglucans«. Internationales Meeting "Stress Signals and Cellular Responses" Halle, März/April 2005
Judith Fliegmann
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»Convergent evolution of plant and animal pattern recognition receptors specific for ß-glucans«. 19. Tagung „Molekularbiologie der Pflanzen", Dabringhausen-Wermelskirchen, März 2006
Judith Fliegmann, Julie Leclercq, Hugues Driguez, Axel Mithöfer, Jürgen Ebel
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»Perception and processing of ß-glucan signals from the cell wall of Phytophthora sojae by the bifunctional ß-glucan binding protein«. Gordon Research Conference on Plant Cell Walls, Biddeford, Maine, USA, August/September 2006
Judith Fliegmann, Alma Djuliċ, Emilie Montel, Jürgen Ebel
