Vergleichende Untersuchung der Photostabilität von einzelmolekültauglichen Fluoreszenzfarbstoffen in einem durchflusszytometrischen Ansatz
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des geförderten Projektes wurde die Photostabilität verschiedener Klassen von grün und gelb fluoreszierenden Farbstoffen verglichen. Untersucht wurden Xanthenfarbstoffe (Fluoresceine, Rhodamine), Fluoreszenzproteine und Bodipyfarbstoffe. Letztere wurden dazu eigens in der Arbeitsgruppe Jung synthetisiert. Als experimentelle Methode wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) gewählt, die zu den Einzelmolekülmethoden gezählt wird. In der FCS wird die Photostabilität, d.h. die Anzahl an überlebten Photozyklen, qualitativ aus der Änderung der sogenannten Diffusionszeit ermittelt. Die durchgeführte Analyse berücksichtigt die unterschiedliche Besetzung des Triplettzustandes, die zu einer veränderten Anzahl an Photozyklen während der Verweildauer im konfokalen Detektionsvolumen führt. Allderdings wurde beim Einsatz der FCS von der Projektskizze abgewichen, indem der vorgesehene Eigenbau eines Durchflusszytometers nach etwa der Hälfte der Projektlaufzeit aufgegeben wurde. Beim Vergleich der Bodipy-Farbstoffe, die sich photophysikalisch lediglich in der Triplettquantenausbeute unterscheiden, stellte sich heraus, dass das Bleichen nicht, wie hinlänglich angenommen, über den Triplettzustand erfolgt, sondern über den Singulettzustand. Dieser Zusammenhang wurde auch bei den Fluorescein-derivaten festgestellt. Der initiale Schritt beim Photobleichen wird interpretiert als Einelektronen-transferreaktion des angeregten Farbstoffes zu molekularem Sauerstoff. Die thermodynamische Beschreibung dieser Reaktion durch die Rehm-Weller-Gleichung favorisiert eine Reaktion aus dem Singulettzustand gegenüber einer Reaktion aus dem Triplettzustand. Diese Interpretation erklärt auch, warum rot-fluoreszierende Farbstoffe generell stabiler sind als kurzwelliger fluoreszierende Farbstoffe. Allerdings verliert der hier entwickelte Reaktionsmechanismus seine Bedeutung bei höheren Farbstoffkonzentrationen als sie in der Einzelmolekülspektroskopie üblich sind: hier fördert die höhere Konzentration an Sensibilisator die Generierung von Singulettsauerstoff, der eine höhere Reaktivität als Triplettsauerstoff besitzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- G. Jung, Fluorescence Correlation Spectroscopy: An Experimentalist¿s View of the basics, in Modern Research and Educational Topics in Microscopy, Formatex Microscopy Book Series 3, Badajoz (Spanien), 2007; S. 855-862.
