Multimodales, konfokales Super-Resolution STED-Mikroskop mit Fast Lifetime Imaging Modalität

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 543363886

Wir beantragen ein "Super resolution"-Mikroskopsystem mit "Stimulated Emission Depletion" (STED), kombiniert mit schnellem "Fluorescence Lifetime Imaging" (FLIM). Dieses System wird es uns ermöglichen, unsere wichtigsten Forschungsziele sowohl in lebenden Zellen und Organismen als auch in fixierten Proben zu untersuchen. Unser Ziel ist es, den Prozess und die Kontrolle der bakteriellen Ribosomen-Biogenese und -Reifung mit dem STED-System in noch nie dagewesener räumlicher Auflösung aufzuklären. Dies erfolgt durch die Analyse der Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten Komponenten wie z.B. der GTPase ObgE oder der DEAD-Box-Helikase DeaD, die in bestimmten Phasen der Ribosomenbiogenese im bakteriellen Nukleoid und bei pharmakologischer Manipulation in lebenden Zellen beteiligt sind. Wir werden die Nukleoidstruktur in ihrer nativen und unter genetisch gestörten Bedingungen, z.B. nach Knockdown bestimmter Proteine, aufklären und die strukturellen und funktionellen Konsequenzen für die Ribosomenbiogenese untersuchen. In Säugetierzellen in Kultur und multizellulären Modellorganismen werden wir 1) den Mechanismus und die Kontrolle der Reifung von naszierenden Proteinen während ihrer Synthese durch das Ribosom untersuchen, speziell die Koordination des Zugangs von Enzymen, die den N-Terminus eines naszierenden Polypeptids modifizieren und welche Faktoren dabei eine Rolle spielen, sowie 2) den Faltungsmechanismus von hetero-oligomeren Proteinkomplexen und 3) die Prozesse, die unter Proteinfaltungsstress ablaufen, aufschlüsseln. Dafür setzen wir "Fluorescence Cross Correlation"-Spektroskopie (FCCS) und FLIM für "Fluorescence Lifetime Correlation"-Spektroskopie (FLCS) ein, um die molekularen Dynamiken in lebenden Zellen zu untersuchen. Mit dem STED-Mikroskop ist es aufgrund des sehr kleinen Beobachtungsvolumens möglich, Diffusionsprozesse auf der Nanoskala zu messen. Um bei FCCS- und FLCS-Analysen in dem minimalen Messvolumen ein Maximum an Photonen zu sammeln, sind sehr empfindliche Detektoren mit möglichst geringer Totzeit erforderlich. Die Größe der in unserem Labor analysierten Proteinaggregate erlaubt nicht nur FLIM/FCCS-Analysen, sondern auch Messungen mittels STED-Mikroskopie. Um ein breites Spektrum an Fluoreszenzmarkern abzudecken, wird das STED-Mikroskop mit zwei Depletions-Lasern ausgestattet. Dies erlaubt nicht nur, zellpermeable Markierungssysteme (SNAP- und Halo-Tags) zu nutzen, die für Bakterien und Säugetierzellen in Kultur geeignet sind, sondern auch Modellorganismen zu analysieren, die nicht für die Verwendung solcher Markierungen geeignet sind, sondern auf klassische fluoreszierende Proteinmarkierungen angewiesen sind. Ein gepulster Weißlicht-Anregungslaser wird das Spektrum der Anregungswellenlängen von 440 bis 790 nm abdecken, was die optimale Anpassung an das Anregungsmaximum der Markierung und eine optimale Signalausbeute ermöglicht und die neuartigen Nah-IR-Markierungen und fluoreszierenden Proteine für Experimente zugänglich macht.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Multimodales, konfokales Super-Resolution STED-Mikroskop mit Fast Lifetime Imaging Modalität
• Gerätegruppe: 5000 Labormikroskope
• Antragstellende Institution: Universität Konstanz
• Leiterin: Professorin Dr. Elke Deuerling