Molekulare Analyse der Signal Transduktion im Rcs Regulationssystem
Biophysik
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der Schwerpunkt in unserem Projektantrag war die strukturelle Charakterisierung von Proteinkomponenten des Rcs (Regulation of Capsule Synthesis) Phosphorelays, eines zentralen Regulationssystems in Enterobakterien. Unsere Strategie war die Aufgliederung der komplexen multimodularen Sensor Kinasen RcsC und RcsD in ihre funktionellen Einheiten und deren strukturelle und funktionelle Analyse durch NMR Spektroskopie als Kerntechnik. Diese Vorgehensweise hat sich bewährt und es konnten im Verlauf der bisherigen Förderperiode die Strukturen von insgesamt drei an der Signalkette beteiligten Proteindomänen gelöst werden. Neben den im Projektantrag vorgeschlagenen Strukturen von RcsD-HPt und RcsC-PR wurde hierbei mit der RcsC-ABL Domäne ein neuer Prototyp eines bislang unbekannten Subtyps aus der Familie der „Phospho-Receiver“ (PR) Domänen erstmals beschrieben. Im weiteren Verlauf des Projekts konnten wir bereits eine weitere RcsC-ABL homologe Domäne in der Sensor Kinase RcsD identifizieren und die Signale des Aminosäure-Rückgrats in NMR Spektren vollständig zuordnen. Die Struktur dieser RcsD- ABL Domäne wird wichtige Hinweise auf spezifische Charakteristika in der 3-D Struktur von ABL Domänen liefern. Über die Funktion der ABL Domänen können wir bislang nur spekulieren. Das aktive Zentrum klassischer PR-Domänen ist in den ABL-Domänen nur noch teilweise enthalten. Ein konservierter Aspartatrest als direkter Phosphor-Acceptor ist noch vorhanden, die üblicherweise hochkonservierte Bindungstasche für Mg2+ Ionen ist jedoch nicht mehr erkennbar. Eine direkte Phosphorylierung könnte daher noch erfolgen, sie würde jedoch einen modifizierten Mechanismus erfordern. Die Umwandlung dreier Helices in flexible Loop- Bereiche in den ABL-Domänen lässt weiterhin Spekulationen über Beteiligungen in Proteininteraktionen zu. Diese Vermutung konnten wir auch bereits durch den Nachweis einer starken Komplexbildung von RcsD-ABL mit RcsB, dem zentralen transkriptionellen Regulator der Rcs Signalkette, untermauern. Gegenwärtig verfolgen wir daher im Wesentlichen zwei Arbeitshypothesen. Zum einen könnten ABL-Domänen Bausteine alternative Phosphorylierungswege darstellen, die etwa in Abhängigkeit von der Signalnatur eingeleitet werden. Die Ausweitung des Phosphorelay-Systems durch zusätzliche Domänen würde die Vielfalt möglicher Kontrollmechanismen erhöhen. Eine zweite Kernfunktion der ABL-Domänen könnte in der Vermittlung und Modulierung von Proteinkontakten innerhalb des Rcs Systems bestehen. PR-Domänen bilden oft die Schnittstellen zur Oligomerisierung von transkriptionellen Regulatoren und eine Deaktivierung der Phosphorylierungsstelle in den ABL-Domänen könnte zu Gunsten einer verstärkten Beteiligung in Komplexbildungen stattgefunden haben. Es wird z.B. eine Heterodimerisierung zwischen RcsC und RcsD postuliert. Nach unseren Befunden wird jedoch dieser Komplex zumindest nicht durch die ABL-Domänen vermittelt. Die weitere funktionelle Untersuchung der ABL-Domänen und ihrer Rolle innerhalb des Rcs Systems ist ein wichtiger Bestandteil unseres Fortsetzungsantrags. Die NMR Strukturen der Domänen RcsD-HPt und RcsC-PR zeigen die wesentlichen Merkmale der entsprechenden Proteinfamilien. Die Struktur von RcsC-PR ist das erste Beispiel einer PR-Domäne aus hybriden Sensor Kinasen und zeigt klassische Merkmale der CheY Familie. RcsD-HPt besteht aus einem relativ starren und für Histidin- Phosphotransferasen charakteristischen 4-Helix Bündel, das auf einer Seite von einer fünften Helix begrenzt wird. Spezifisch für RcsD-HPt ist ein Knick in Helix II, verursacht durch ein Prolin. Die dadurch erhöhte Flexibilität könnte eine Rolle in Interaktionen mit anderen Rcs Proteinen spielen. Am Rcs-Phosphorelay beteiligte Proteine besitzen vermutlich eine starke konformelle Dynamik die durch Phosphorylierung kontrolliert wird. Am Beispiel von RcsC- PR konnten wir eine solche starke konformelle Änderung sowohl im Beisein von BeF3-, einer Substanz die eine stabile Phosphorylierung von Proteinen imitieren kann, als auch durch einen Aspartat zu Glutamat Austausch im aktiven Zentrum der Domäne feststellen. Diese Punktmutation simuliert ebenfalls eine Phosphorylierung der RcsC-PR Domäne. RcsD-HPt bildet relativ starke Komplexe mit unphosphoryliertem RcsB und phosphoryliertem RcsC-PR und wir konnten die Erkennungsstellen für beide Proteine auf der Oberfläche von RcsD-HPt kartieren. Dieser Befund liefert ein starkes Indiz für einen gerichteten Phosphorelay Mechanismus von RcsC-PR -> RcsD-HPt -> RcsB und er bietet eine fundierte Grundlage zur strukturellen Charakterisierung der Komplexe. Die erarbeiteten Resultate bieten eine fundierte Grundlage und Perspektive für weiterführende Untersuchungen. Unsere Projektvorschläge sind ausführlich im Fortsetzungsantrag erläutert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2004) Assignment of 1H, 13C and 15N resonances of the Escherichia coli YojN histidine-phosphotransferase (HPt) domain. J. Biomol. NMR, 30, 103-104
Rogov, V.V., Löhr, F., Bernhard, F. and Dötsch, V.
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(2004) Solution structure of the Escherichia coli YojN histidine-phosphotransferase domain and its interaction with cognate phosphoryl receiver domains. J. Mol. Biol., 343, 1035 -1048
Rogov, V., Bernhard, F., Löhr, F., Dötsch, V.
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(2005) Triple-resonance methods for complete resonance assignment of aromatic protons and directly bound heteronuclei in histidine and tryptophan residues. J. Biomol. NMR., 32, 309-328
Löhr, F., Rogov, V.V., Shi, M., Bernhard, F., and Dötsch V.
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(2006) A new structural domain in the Escherichia coli RcsC hybrid sensor kinase connects histidine kinase and phosphoreceiver domains. J. Mol. Biol., 364, 68-79
Rogov, V.V., Rogova, N.Y., Bernhard, F., Koglin, A., Löhr, F. and Dötsch, V.
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(2007) Improved pulse sequences for sequence specific assignment of aromatic proton resonances in proteins. J. Biomol. NMR., 37, 205-224
Löhr, F., Hänsel, R., Rogov, V.V., and Dötsch, V.
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(2007) Letter to the Editor: NMR assignment of 1H, 13C and 15N resonances of the truncated Escherichia coli RcsC (700-949), including the phosphoreceiver domain. J. Biomol. NMR., 38, 165
Rogov, V.V., Löhr, F., Rogova, N., Klammt, C., Koglin, A., Bernhard, F. and Dötsch, V.
