Cell-based assays using bioelectronic sensor-chips for the dynamic analysis of tumor cell metabolism and chemosensitivity
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der Energiestoffwechsel von Krebszellen muss sich den Gegebenheiten einer mangelnden Versorgung anpassen. Da der Tumormetabolismus ein wichtiger Parameter für die Diagnostik und Therapie ist, wurden in diesem Projekt die extrazelluläre Ansäuerung, Sauerstoffmangel (Hypoxie) und niedrige Nährstoffspiegel bezüglich ihrer Wirkungen auf Zellwachstum, Stoffwechsel und Sekretionsmuster untersucht. Als Modellsystem für die unterschiedliche Malignität von Tumoren dienten zwei humane Mammacarcinom-Zelllinien unterschiedlicher Malignität: die hormonsensitiven MCF-7 und die hormoninsensitiven MDA-MB231 mit hohem Metastasierungspotential. Für die Analytik kamen zwei hochempfindliche Technologien zum Einsatz: ein zellbasiertes elektronisches Sensorchip-Testsystem und die LC-MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Um das Tumormikromilieu zu simulieren wurden die Tumorzelllinien in Medium mit reduziertem Serumgehalt und verschiedenen Zusammensetzungen an Glukose. Glutamin und weiterer Metabolite so wie bei saueren pH-Werten und Hypoxie kultiviert. Die zentralen Fragen waren: Wie verändert sich der Metabolismus mit verschiedenen Parametern des Tumormikromilieus? Welche Unterschiede zeigen diese beiden Zelllinien in ihrem Metabolismus? Zellbiologische und biochemische Methoden wurden eingesetzt, um ein Netzwerk an Mikromilieu-ähnlichen Kulturbedingungen zu bearbeiten. In ausgewählten Kulturbedingungen wurden Zellen für dynamische Untersuchungen des Stoffwechsels auf multiparametrischen Sensorchips kultiviert und die Veränderungen in der extrazellulären Ansäuerungsaktivität und O2-Verbrauch mehrere Tage kontinuierlich verfolgt. Die Reduktion des Serumgehaltes auf 1% im Kulturmedium drosselte unmittelbar die Ansäuerungsaktivität und den Sauerstoffkonsum der Zellen; das demonstriert die rasche Anpassungsfähigkeit des Stoffwechsels an ein verändertes Mikromilieu. Der Einsatz limitierender Nährstoffkonzentrationen ergab, dass ein bestimmtes Glutamin / Glukose-Verhältnis (l / 25) den Stoffwechsel (Aktivität der Pyruvatkinase und die von Dehydrogenasen) besonders erhöhte ohne das Zellwachstum entsprechend zu fördern. Extrazelluläres Pyruvat und Laktat hatten ebenfalls wenig Einfluss auf die Zellzahl, reduzierten bzw. erhöhten aber die Dehydrogenaseaktivität auf gegensätzliche Weise. Somit ist das Zellwachstum nicht ein Spiegel des Energiemetabolismus dieser Tumorzellen. Bei beiden Zelllinien reduziertes sich das Zellwachstum ab pH 7,0 mit zunehmender Azidität des Mediums bis bei pH 6,6 Zellwachstum und Stoffwechsel minimal waren. In all diesen Versuchen war bisher kein Unterschied zwischen den beiden unterschiedlich malignen Zelllinien ersichtlich. Die reduzierten Kulturbedingungen hatten kaum Einfluss auf die Chemosensitivität von Doxorubicin und Tamoxifen. Metabolische Sensorchipmessungen zeigten, dass Doxorubicin bei MCF-7 Zellen nach etwa sechs Stunden die Atmungsaktivität, später auch die Ansäuerungsaktivität hemmte. Mit dem glykolytisehen Hemmstoff 2-Desoxy-Glukose wurde dagegen eine rasche Hemmung der Ansäuerungsaktivität gemessen. Neben den Metaboliten sekretieren Tumorzellen auch zahlreiche Substanzen, deren Muster ebenfalls diagnostische und therapeutische Informationen vermitteln könnten. Mit einer verbesserten Isolierung mittels eigens hergestellter magnetischer Mikropartikel und einem empfindlicheren massenspektrometrischen Verfahren konnten erstmals spezifische Muster solcher Substanzen in Kulturüberständen von MCF-7 und MDA-MB231 Zellen im picomolarem Bereich reproduzierbar detektiert werden. Hiermit stehen nun - in Kombination mit einem definierten, kontrollierbaren Kultursystem zur systematischen Simulation von Parametern des Tumormikromilieus - zwei Technologien zur analytischen und dynamischen Charakterisierung von Tumorzellen über ihren Metabolismus und das Sekretom zur Verfügung.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Effects of low nutrient and growth factor levels on tumor cell metabolism. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, TU Braunschweig 29.03. - 01.04.2006. Eur.J.Cell Biology, 85S1, Suppl. 56, p.41
A.M. Otto, C. Janzon, I. Szabados, B. Wolf
- Impedance sensor chips for analyzing the proliferation, morphology and adhesion of adherent cell culture. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, TU Braunschweig 29.03. -01.04.2006
Cabala, E., Brückl, M., Otto, A.M., Brischwein, M., Wolf, B.
- Analysis of energy metabolism in tumor cells cultured under low nutrient conditions: comparison of dynamic and end-point vitality assays. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, Universität Frankfurt 14. -17.03. 2007. Eur.J.Cell Biology, 86S1, Suppl. 57, p.42
Otto, A.M., Janzon, C., Szabados, I., Hopfner, U., Peter, J. F., Wolf, B.
- Complex patterns of interaction of low nutrient and growth factor levels for regulating energy metabolism in tumor cells. 14th International AEK Cancer Congress, Universität Frankfurt, 28.02. - 02.03.2007
Otto, A.M., Janzon, C., Szabados, I., Hopfner, U., Wolf, B.
- Enrichment and detection of molecules secreted by tumor cells using magnetic reversed phase particles and LC-MALDI-TOF-MS. International Symposium of The Association of Biomolecular Resource Facilities, Tampa, Florida, USA, 13.07. - 03.04.2007
Peter, J.F., Otto, A.M., Wolf, B.
- The use of magnetic nano-particles and mass spectrometry (LC-MALDI-TOF-MS) for the enrichment and detection of molecules secreted by tumor cells. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, Universität Frankfurt 14. -17.03. 2007. Eur.J.Cell Biology, 86S1, Suppl. 57, p.43
Peter, J.F., Otto, A.M, Wolf, B.
