Signalstrukturen der enteroviralen Replikation und Translation: Interaktion des humanen Poly(rC)-bindenden Proteins 2 mit Enterovirus-RNA
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die bei Enteroviren hochkonservierte 5'-nichttranslatierte Region (5'-NTR; Domänen I-VII) des Positivstrang-RNA-Genoms trägt essentielle Signalstrukturen für die Initiation der Replikation (Domäne l) und der cap-unabhängigen Translation (Domänen ll-VII; interne Ribosomeneintrittsstelle - „IRES"). Die Bindung des humanen Poly(rC)-bindenden Proteins 2 (PCBP2) über zwei seiner drei hnRNP-K-homologe (KH)-Domänen an die RNA-Domänen l und IV der 5'-NTR beeinflusst das Umschalten von viraler Translation auf virale RNA-Synthese. Die Interaktion von PCBP2 mit der Coxsackievirus B3 (CVB3)- RNA soWte mittels quaWtat'tver und quantitativer Bindungsstudien in vitro und Translationstests in vivo funktionell sowie strukturell analysiert werden. Die Bindung von PCBP2 an Bereiche der Domäne IV ist deutlich abhängig von der Loop- Bindestelle in IVC, während die Anwesenheit der Loop-Bindestelle in IVB geringen Einfluss auf die Bindung hat. Die Mutation der untersuchten Bulges in IVB und IVC hat keinen signifikanten Einfluss auf die PCBP2-Bindung. Beide Loop-Bindestellen für PCBP2 sind für eine volle in vivo Translationsaktivität notwendig, wobei der Einfluss des IVC-Loop ausgeprägter ist. Eine Mutation der untersuchten Bulge-Bereiche hat einen starken Einfluss auf die Translationsaktivität der CVB3 IRES. Dies legt nahe, dass die Bulge-Bereiche unabhängig von PCBP2 Einfluss auf die Topologie der IRES und damit auf deren Interaktion mit dem zellulären Translationsapparat haben. Die erste PCBP2 KH-Domäne (KH1) interagiert direkt mit der von Gamarnik & Andino (2000) postulierten Bindestelle in Subdomäne IVC (Loop A335-C341), bewirkt dabei jedoch außerhalb der Bindungsstelle keine signifikanten Konformationsänderungen. Die KH3-Domäne interagiert direkt mit IVB. Diese Bindung wird durch stabilisierende IVB-Mutationen an bestimmten Positionen beeinträchtigt. Die Ergebnisse deuten auf eine Konformationsänderung auch außerhalb des kanonischen KH-ACCCCA-Bindemotivs hin. Die RNA-Bindung involviert auf KH3-Seite die für KH-Domänen typischen Bereiche. Subdomäne IVB bildet eine Haarnadelstruktur mit zwei A-helikalen Bereichen aus, die durch einen zentralen CA-Bulge getrennt sind. Der C-Rest des Bulge stapelt auf die 5'-gelegene Base, und der A-Rest recht in die kleine Furche der benachbarten Helix. Keiner der Reste zeigt in das Lösungsmittel. Der apikale U301ACCCCA307-LooP nimmt eine teilweise geordnete Konformation an, das im Sekundärstrukturmodell vorhergesagte U301:A307 „closing base pair" bildet keine Watson-Crick-Wasserstoffbrücken aus. Apikaler Loop und CA-Bulge zeigen eine erhöhte Dynamik. Eine volle Strukturaufklärung der Komplexe mittels NMR-Spektroskopie in Lösung war aus technischen Gründen (Löslichkeit, Aggregations neig ung) nicht möglich.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2008 Interaction of poly(rC)-binding protein 2 domains KH1 and KH3 with coxsackievirus RNA. Biochem Biophys Res Commun. 377(2):500-3
Zell R, Ihle Y, Effenberger M, Seitz S, Wutzler P, Görlach M
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2008 Poly(rC)-binding protein 2 interacts with the oligo(rC) tract of coxsackievirus B3. Biochem Biophys Res Commun. 366(4):917-21
Zell R, Ihle Y, Seitz S, Gündel U, Wutzier P, Görlach M
