Investigation of DNA double strand break repair in Bacillus subtilis
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die wichtigsten wissenschaftlichen Fortschritte: A) RecA Protein akkumuliert nach 30 bis 60 Minuten in den durch RecN initiierten DNA-Reparaturzentren (RCs) und bildet im Folgenden dynamische filamentöse Strukturen, die anscheinen nach homologen DNA Strängen im gesamten Nukleoid suchen. Demnach etabliert Bacillus subtilis anscheinen crossovers über eine Distanz von mehreren Micrometern, die die Zellen 2 bis 4 µm lang sind. Diese Daten weisen ein komplett neuartiges Bild über die räumliche Organisation der DSB Reparatur in einem Prokaryonten auf. B) RecN ist das erste Protein, dass in den RCs akkumuliert, was auch in Abwesenheit von end processing geschieht, wonach RecN unabhängig DSBs erkennt oder eines der ersten diese Strukturen erkennende Proteine darstellt. C) RecU akkumuliert zu einem späten Zeitpunkt in RCs, in Abhängigkeit von RuvAB, und im Einklang mit seiner Funktion als Resolvase für Holiday junctions in vivo. D) Die Aufnahme von DNA durch kompetente Bakterien und deren Integration in das Genom sind ein räumlich hochgradig organisierter Vorgang. DNA wird an einem Zellpol aufgenommen, und dort durch RecN und RecA Proteine in Empfang genommen. RecN weist ssDNA Bindung auf, und ist das erste SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) Protein, welches diese Aktivität zeigt. Nachfolgend bildet RecA dynamische thread Strukturen aus, die die aufgenommene DNA vom Zellpol zum Chromosom führen und dort die Integration ins Chromosom (Ausbildung eines Homo- oder Heteroduplex) katalysieren. E) DprA (Smf) spielt bei der Beladung von ssDNA mit RecA eine wichtige Rolle (Labor R. Claverys, Frankreich). Im Einklang mit dieser Rolle akkumuliert DprA an der Kompetenzmaschinerie am Zellpol. Nach Zugabe von DNA löst sich die Assemblierung von DprA jedoch auf, abhängig von RecA, was darauf hinweist, dass DprA eventuell mit den RecA threads mitwandert. Die Visualisierung von Rekombinationsproteinen konnte also wichtige Hinweise für den Ablauf der DNA DSB Reparatur und den horizontalen Gentransfer durch Kompetenz erbringen. Die weitergeführten Versuche zielen darauf ab, die Prozesse bis in alle molekularen Details zu verstehen. Das Prinzip der DSB Reparatur ist in allen Zellen konserviert, somit erbringen unsere Arbeiten auch Einsicht in den Prozess in eukaryontischen Zellen. Fernziel des Projekts zu Transformation von Bacillus ist, mögliche Hemmstoffe zu entwickeln, um die Verbreitung von Resistenzgenen vor allem in Krankenhäusern zu unterbinden, bzw. zu verlangsamen; dazu benötigt man aber Information über alle beteiligte Proteine und deren Mechanismus.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2005) Dynamic formation of RecA filaments at DNA double strand break repair centres in live cells. J. Cell. Biol. 170: 357-366
Kidane, D. and P. L. Graumann
- (2005) Intracellular protein and DNA dynamics in competent Bacillus subtilis cells. Cell 122: 73-84
Kidane, D. and P. L. Graumann
- (2005) The RuvAB branch migration translocase and RecU Holliday junction resolvase are required for double-stranded DNA break repair in Bacillus subtilis. Genetics 171: 873-883
Sanchez, H., D. Kidane, P. Reed, M. C. Cozar, P. L. Graumann, G. J. Sharples and J. C. Alonso
- (2006) Recruitment of Bacillus subtilis RecN to DNA double-strand breaks in the absence of DNA end-processing. J. Bacteriol. 188: 353-360
Sanchez, H., D. Kidane, M. C. Cozar, P. L. Graumann and J. C. Alonso
- (2007) DprA/Smf protein localizes at the DNA uptake machinery in competent Bacillus subtilis cells. BMC Microbiology 7: 105
Tadesse, S. and P. L. Graumann
