Proteasome molecular composition, biosynthesis, turnover and function during viral infection
Final Report Abstract
Das 20S Proteasom ist das zentrale proteolytische System im Zytoplasma und im Kem einer jeden eukaryotischen Zelle. Das zylindrisch aufgebaute 20S Proteasom besitzt drei katalytisch aktive Untereinheiten (ßl, ß2, ß3), die im Normalzustand in den menschlichen Organen exprimiert werden. Im Falle einer Infektion werden die entzündungsfördemden Zytokine Interferon (IFN)-Y und Tumor Nekrosefaktor (TNF)-a ausgeschüttet, die eine starke Neusynthese der induzierbaren aktiven Untereinheiten ßli (LMP2). ß2i (MECL-1) und ß5i (LMP7) bewirken, welche die jeweiligen homologen, konstitutiv exprimierten Untereinheiten t)eim Zusammenbau neuer Proteasomen. den sogenannten Immunproteasomen. ersetzen. Zu Beginn dieses Projektes konnten wir zeigen, dass die Infektion von Mäusen mit dem Lymphozytären Choriomeningitis Vims (LCMV) zu einer kompletten Umwandlung von konstitutiven zu Immunproteasomen in mehreren Organen führt (Leber, Niere, Lunge, Dünndarm. Dickdarm, Herz, Milz, Thymus), nicht aber im Gehirn. Selbst eine intrakraniale (i.e.) hifektion, die mit hohen Virustitera und mRNAs für IFN-y, LMP2, MECL-1 und LMP7 einhergeht, führte nur zu sehr geringer Formation von Immunproteasomen. Stattdessen konnten wir mit Hilfe von Saccharosegradienten feststellen, dass im Gehirn Voriäufer von LMP2, und MECL-1, die beim Zusammenbau des Immunproteasoms N-terminal prozessiert werden, akkumulieren, welches sie in anderen Organen nicht tun. Zelllinien von Neuroblasten ergaben bei WN-y Stimulation aber eine normale Formalion von Immunproteasomen. Wir haben daher mit Hilfe von neuen affinitätsgereinigten Antikörpem gegen LMP2 und MECL-1 Doppelfärbungen von Zellen im Maushim etabliert, die Mikroglia stark anfärbten, und die in i.e. LCMV infizierten LMP2"'" und MECL-l"'" Mäusen keine Färbung geben. Astrozyten zeigten hingegen keineriei Immunproteasomfärbung. Primärkulturen von Mausastrozyten konnten zwar mit IFN-y zur Produktion von Vorläufern von LMP7 und LMP2 stimuliert werden, diese wurden jedoch nicht prozessiert. Wir nehmen daher an, dass Astrozyten gegen den Angriff von zytotoxischen T Lymphozyten (CTL), die Immunproteasom-abhängige Epitope erkennen, geschützt sind. In einem zweiten Teil des Projektes haben wir die Immunantwort von MECL-r''Mäusen auf die Infektion mit LCMV untersucht. Wir konnten zeigen, dass die CTL Antwort gegen das GP276 Epitop sehr stark reduziert ist, dass dieses aber nichl am Unvermögen von MECL-1 defizienten Zellen liegt, dieses Epitop zu präsentieren. Wir konnten hingegen zeigen, dass die CTL Vorläuferzellen für dieses Epitop im peripheren Repertoire deudich dezimiert waren, welches den ersten Hinweis auf eine Rolle des Immunproteasoms für die thymische T Zellselektion ergab (J. ImmunoL 176:6665). Eine weitere wichtige Erkenntnis zur Antigenprozessiemng gelang eher zufällig bei Arbeilen mit LMP2 und LMP7-spezifischen Inhibitoren: wir konnten für das männliche minor Epitop Uty246-254 zeigen, dass es LMP2 für die Prozessiemng braucht, dass aber nicht die peptidolylische Aktivität von ßli (LMP2) erforderlich ist, sondem seine Eigenschaft, den Einbau des konstitutiven Homologs ßl zu verhindem, da dessen caspase-ähnliche Aktivität das Uty246.254 Epitop zerstört. Die Unterdrückung des Einbaus von konstitutiven Untereinheiten könnte auch Befunde erklären, wo z.B. die Struktur von LMP7, nicht aber seine katalytische Aktivität für den Erhalt zweier Epitope benötigt wurde. Zu Beginn unseres Projektes wurde von Neefjes und Kollegen publiziert, dass die Tripeptidylpeptidase II dem Proteasom nachgeschaltet und generell an der Prozessierung von MHC I Liganden beteiligt ist. Wir haben daraufhin die Präsentation von LCMV Epitopen und anderer CTL Epitope auf die Beeinflussung durch TPPII Inhibitoren untersucht und konnten keine-Inhibition der Präsentation von acht verschiedenen Epitopen feststellen. Die Präsentation des GP276 Epitops wurde allerdings durch eine Überexpression von TPPII leicht vermindert. TPPII ist daher nicht generell erforderlich für die Klasse I Präsentation sondem zerstört eher Epitope als dass sie sie erzeugt (Eur J. Immunol 37:896). Abgeschlossen wurde im Rahmen dieses Projektes eine Untersuchung der Prozessiemng eines Epitops im Endoplasmatischen Retikulum (ER) leader eines Antigens des Prostatakarzinoms, dem prostate stem cell antigen (PSCA14.22). Dieses immundominante Epitop wird nämlich im Lumen des ER durch die ER leader Peptidase zerstört, woraus wir schliessen können, dass dieses Epitop ausschliesslich im Zytoplasma prozessiert wird, ohne die Beteiligung des ER-assoziierten Abbaus. Es handelt sich hierbei um einen neuen, ER-unabhängigen Prozessierungsweg, der aber auch die Aktivitäten des Proteasoms und des TAP Transporters benötigt {EMBO Reports 8:945).
Publications
- Basler, M. and Groettrup, M. (2007) No essential role for tripeptidyl peptidase II for the processing of LCMV-derived T cell epitopes. Eur. J. Immunol. 31,896-904.
- Basler, M., Moebius, J., Elenich, L., Groettrup, M. and Monaco, J. J. (2006) An altered T cell repertoire in MECL-1-deficient mice. J. Immunol 176,6665-6672.
- Schlosser, E., Otero, C, Kessler, B., Edelmann, M., Brunisholz, R., Legier, D. and Groettrup, M. (2007) A prostate carcinoma antigen reveals a novel cytosolic class I processing pathway for endoplasmic reticulum targeted proteins. EMBO Rep. 8,945-951
