Regulation neuronaler Kalium-Kanäle durch zeitlich-räumliche Änderungen der Phosphoinositid-Konzentration der Zellmembran
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zahlreiche neuronale Ionenkanäle können durch exogene Membranlipide, vor allem Phosphoinositide (PI) wie PI(4,5)P2, in ihrem Verhalten moduliert werden. Es wurde daher angenommen, dass das Erregungsverhalten von Neuronen durch die spezifische Lipidzusammensetzung der Zellmembran, vor allem aber dynamisch durch zeitlich-räumliche Änderungen der Phosphoinositid-Konzentrationen reguliert wird. Tatsächlich war jedoch weitgehend unklar, ob Ionenkanäle in ihrer neuronalen Umgebung tatsächlich über Phosphoinositide reguliert werden, da eine gezielte Veränderung der endogenen PI-Konzentrationen methodisch nicht möglich war. Ziele dieses Projektes war daher festzustellen, in welchem Ausmaß und mit welcher Spezifität Kanalaktivität und -eigenschaften im intakten zellulären Milieu von den Membran-PI-Konzentrationen abhängen. Weiterhin war zu klären in welchem Ausmaß und mit welchem räumlich-zeitlichen Muster PI-Dynamik in Neuronen tatsächlich auftreten. Wir haben zur Beantwortung dieser Fragen neue Methoden zur gezielten Veränderung der PI-Konzentrationen in lebenden Zellen und zur Detektion von PI(4,5)P2-Dynamiken in Neuronen entwickelt. Zunächst haben wir die kürzlich identifizierte PI-Phosphatase Ci-VSP bezüglich ihrer Aktivierung durch Änderungen des Membranpotentials und bezüglich ihrer enzymatischen Spezifität charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass Ci-VSP eine spannungsgesteuerte 5’-Phosphoinositid-Phosphatase ist, die es erlaubt, die zelluläre PI(4,5)P2-Konzentration schnell, reversibel und graduell zu depletieren. Damit eigenet sich Ci-VSP optimal als Tool zur Analyse der PI(4,5)P2-Kontrolle zellulärer Prozesse. Entsprechend haben wir anschließend die PI(4,5)P2- Abhängigkeit verschiedener K+-Kanäle untersucht und konnten die relativen PI(4,5)P2-Affinitäten von Kv7 und Kir-Kanälen bestimmen. Demgegenüber fanden wir, dass die Aktivität von TASK-K+-Kanälen und das Inaktivierungsverhalten von Kv- Kanälen nicht spezifisch von PI(4,5)P2 kontrolliert wird. Für die Mesung von PI(4,5)P2-Dynamiken in lebenden Zellen haben wir eine neue Sensor-Proteindomäne, tubbyC, charakterisiert. Im Gegensatz zum verbreitet verwendeten PI(4,5)P2-Sensor PLCδ1-PH, bindet tubbyC nicht an IP3 und kann daher zur zuverlässigen Detektion von Änderungen der PI(4,5)P2-Konzentration verwendet werden, die durch Aktivierung von PhospholipaseC über Gq-gekoppelte Rezeptoren verursacht werden. Durch Messung der Membranassoziation von tubbyC in primärkultivierten hippocampalen Neuronen mittels TIRF-Mikroskopie konnten wir zeigen, dass die Aktivierung von Gq-gekoppelten muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren zur PI(4,5)P2-Depletion in Soma, Dendriten und postsynaptischen Spines führt. Damit kommt der PI(4,5)P2-Konzentration tatsächlich eine wichtige Rolle bei der Regulation bestimmter neuronaler Ionenkanäle zu.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009). Ci-VSP is a depolarizationactivated phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate and phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 5'-phosphatase. J Biol Chem 284, 2106-2113
Halaszovich, C.R., Schreiber, D.N., and Oliver, D.
