Reproduzierbare Synthese von Cyclotiden in Pflanzenzellkulturen. 2. Produktionsoptimierung und Verfahrensentwicklung
Final Report Abstract
Bei Oldenlandia affinis-Suspensionskulturen konnte durch systematische Untersuchungen bestätigt werden, dass die Saccharosekonzentration, Cytokiningaben, die Bestrahlung, sowie die Animpfdichte und das Alter der Vorkultur Einfluss auf das Wachstumsverhalten, die Wachstumsphasen und die Chlorophyllgehalte haben. In diesen Untersuchungen wurde deutlich, dass die bisher postulierte Korrelation der Chlorophyllakkumulation mit der Kalata B1-Synthese nicht verifizierbar ist. Bei der Analyse von Prozessparametern hatte insbesondere das Vorkulturalter Einfluss auf Wachstum und Produktbildung. Die Unabhängigkeit der Kalata B1-Synthese vom Wachstum der Zellkultur konnte wiederholt gezeigt werden. Je nach Kulturbedingung wurden intrazellulär Produktivitäten bis zu 0,598 mg L-1 d-1 mit einer 7-tägigen Vorkultur unter mixotrophem Kulturmodus in Schüttelkolben und bis zu 0,115 mg L-1 d-1 unter heterotrophen Bedingungen im Rührreaktor erzielt. In der Mediumsanalyse wurden 0,52 mg L-1 (13,3 %) und 0,58 mg Kalata B1 L-1 (84,9 %) bei intrazellulären Gehalten von 0,041 bzw. 0,035 mg g-1 nachgewiesen. Bei 0,021 mg g-1 intrazellulär akkumulierten Kalata B1 ergaben sich einmalig 96,2 % (5,61 mg Kalata B1 L-1) nach Elicitierung mit Chitosan im Medium. Dieses entspricht einer Gesamtproduktivität von 1,425 mg L-1 d-1 im Vergleich zu 0,222 bzw. 0,171 mg L-1 d-1. Erfolgreich hinsichtlich der quantitativen und qualitativen Produktionssteigerung war die Adaption der Suspensionskulturen an Chitosan. Es wurden stressresistente Zelllinien etabliert, die verstärkt Kalata B1-Peptide akkumulieren. Durch Adaption an Chitosan wurden nach 7 Kulturtagen 0,72 mg g-1 Kalata B1 intrazellulär akkumuliert und 2,32 mg L-1 (24,4 %) im Medium detektiert, welches der Produktivität von 1,369 mg Kalata B1 L-1 d-1 entspricht. Eine nachfolgende Elicitierung durch Methyljasmonat resultierte am Ende der Prozesse in der 6fachen Steigerung sowie einer 2fachen Peptid-Produktion nach Einsatz von Kupfersulfat. In kooperativen Studien mit der AG Craik, Institute of Molecular Bioscience, The University of Queensland, wurden fünf bekannte Kalata-Peptide (B1, B2, B7, B16/17) und 12 neuartige Peptide in der Biomasse identifiziert, deren Produktion licht- und wachstumsphasenabhängig war. Auf Prozessebene wurden konstruktive Modifikationen der 1 L-Photobioreaktor-Screening-Module vorgenommen und erfolgreiche Kultivierungen im 1-L-Airliftreaktor, 10-L-Rührreaktor und 25-L- Photobioreaktor durchgeführt. Die Gewinnung der Cyclotide wurde hinsichtlich Kalata B1 optimiert und die SDS-PAGE als alternative Methoden zur HPLC-Analytik getestet. Ferner wurde eine Methode etabliert, mit der die Transkription von Oak1, dem Gen für den Kalata B1-Prekursor, im Vergleich zu dem Haushaltsgen OaGAPDH quantifiziert werden kann. Mit dieser Analytik konnte Oak1 in Lichtkulturen (phototroph, mixotroph) und in heterotroph wachsenden Kulturen nachgewiesen werden.
Publications
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