Verifizierung und Funktion einer bifunktionellen Glykosidase in einer autotroph wachsenden Zellkultur von Chenopodium rubrum
Final Report Abstract
Zellkulturen von Chenopodium rubrum können photoautotroph auf CO2 als alleiniger Kohlenstoffquelle gezogen werden. Die Entwicklung einer solchen Batchkultur verläuft in Phasen, die denen eines Blattes ähneln: Zellteilung und Wachstum, stationäre Phase, Seneszenz und Absterben. Gegen Ende der Zellteilungs- und dann wieder während der stationären Phase wird das Gen einer ß-Xylo-ß-glucosidase verstärkt exprimiert. Die Rolle und Bedeutung dieses Enzyms sollte untersucht werden. Von der Zellkultur wurden 2 transformante Linien hergestellt: Eine „Loss-of-function“- Linie durch RNAi (ChenGlucRNAi), sowie eine Kontroll-Linie mit dem leeren Vektor. Beide Linien wachsen (photoautotroph) wesentlich langsamer als der „Wildtyp“ (Übergang zur stationären Phase nach 60 statt nach 30 Tagen); aber die RNAi-Linie wächst nur halb so schnell wie die Kontroll-Linie und erreicht maximal nur 40% der Zellzahl. In dem Projekt sollte 1. das Genprodukt proteinbiochemisch charakterisiert werden, und 2. eine Erklärung dafür gesucht werden, warum transformierte Zellen, die das Genprodukt nicht bilden können (ChenGlucRNAi-Zellen) sich wesentlich langsamer teilen. Dazu wurden 2 Hypothesen aufgestellt: a) das Genprodukt ist am Phytohormonmetabolismus beteiligt; seine Funktion besteht in der Remobilisierung der für die Zellteilung wichtigen Hormone Auxin und Cytokinin aus inaktiven vakuolären Depotformen. b) die ß-Xyloglucosidase ist für den Aufbau oder/und die Veränderung der Zellwand im Laufe der Entwicklung der Suspensionskulturzellen notwendig. Das erste Ziel wurde nur ansatzweise erreicht, da nur eine ß-Glucosidase- aber keine ß- Xylosidase-Aktivität des in transformierten Tabakblättern exprimierten Proteins nachgewiesen werden konnte. Das zweite Ziel wurde in der Weise erreicht, dass eine Beteiligung des Genprodukts an der Remobilisierung von Phytohormonen aus Konjugaten ausgeschlossen und die Lokalisation des Proteins in der Zellwand nachgewiesen werden konnte. Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Enzym in planta an der Bildung der Interzellularen durch Hydrolyse von Matrixpolysacchariden beteiligt sein könnte. In der Zellkultur könnte es für die Abtrennung einzelner Zellen aus den Mikrokalli nötig sein. Die Untersuchungen zur Lokalisierung und Charakterisierung des Proteins sind noch nicht völlig abgeschlossen. Wir planen eine Publikation über die Lokalisierung des Enzyms in der Zellwand und hoffen, dafür noch mehr Daten, vor allem über die Substratspezifität erarbeiten zu können.
