Entwicklung höchst leistungsfähiger, Cystein-freier gespaltener Inteine als vielseitige Werkzeuge für neue Anwendung in der Proteinmanipulation

• Antragsteller: Professor Dr. Henning D. Mootz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 545035351

Inteine entfernen sich selbst aus einem Vorläuferprotein durch die mehrstufige Reaktion des Protein-Spleißens. Dabei werden die N- und C-terminal flankierenden Sequenzen (Exteine) mit einer nativen Peptidbindung verknüpft. Protein-Spleißen ist nahezu spurlos und erfordert streng genommen nur den Verbleib einer einzigen Aminosäure (Cystein, Serin oder Threonin) an der Spleißstelle. Gespaltene Inteine weisen eine in zwei Fragmente separierte Intein-Domäne auf, die Protein-trans-Spleißen zwischen zwei Vorläufterproteinen nach Assoziation und Faltung katalysieren. Vor allem gespaltene Inteine haben eine Vielfalt einzigartiger Techniken hervorgebracht, mit denen die Struktur und Funktion von Proteinen auf posttrans-lationaler Ebene manipuliert werden kann. Entscheidende Vorteile sind die inhärente Affinität und die spurlose Reaktionsführung. Dieser Antrag befasst sich mit Cystein-freien gespaltenen Inteinen, die eine sehr kleine Fraktion aller bekannter Inteine ausmachen. Cystein-freie Inteine haben keine Cysteinreste und sind in ihren Acylumlagerungsreaktionen des Protein-Spleißens nicht von Cysteinen abhängig. Cystein-freie gespaltene Intein haben erst kürzlich Aufmerksamkeit als besonders nützliche Proteinwerkzeuge erreicht. Sie können die Protein-trans-Spleißreaktion in der Abwesenheit von Reduktionsmitteln und in oxidativem Milieu durchführen. Diese Schlüsseleigenschaft ist von enormer praktischer Bedeutung, zum Beispiel im Falle gereinigter Proteine mit reduktionsempfindlichen Disulfidbrücken oder wenn Proteine auf der Oberfläche von Säugerzellen modifizierten werden sollen und so der Kollateralschaden an zahllosen Disulfid-stabilisierten Rezeptorproteinen vermieden werden kann. Wir haben zuvor die ersten beiden Cystein-freien gespaltenen Inteine beschrieben, die prinzipiell für allgemeine Proteinmanipulationen geeignet sind. Allerdings waren ihre Einsatzmöglichkeiten durch beeinträchtigte Faltungs- und Spleißeigenschaften stark eingeschränkt. In diesem Projekt planen wir, diesen beiden gespaltenen Inteine durch rationales Proteindesign und gerichtete Proteinevolution zu hoch optimierten Varianten zu verbessern. Weiterhin werden wir ihr Potential durch die Entwicklung einiger neuartiger und innovativer Proteinmanipulationsmethoden unterstreichen. Diese Methoden werden schlagkräftige neue Möglichkeiten ergeben, zum Beispiel für die minimalinvasive Markierung von Zelloberflächenproteinen, die mehrfach-selektive Proteinmarkierung, den Mehrfach-Einbau verschiedener unnatürlicher Aminosäuren und die erste Intein-vermittelte Protein-Protein-Konjugation über eine Seitenkette. Schlußendlich werden wir ein tieferes Verständnis der Sequenz- und Mechanismusunterschiede Cystein-freier Inteine zu ihren Cystein-abhängigen Verwandten erzielen, genauso wie unsere Strategien zur ihrer Verbesserung auf den ersten Erkenntnissen hierzu beruhen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen