Functional Implications of Heme-packing Motives in c-type Cytochromes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des vorliegenden Antrags wurde das Dihäm-Cytochrom DHC2 aus G. sulfurreducens als Modellsystem zur Untersuchung des parallelen Häm-Packungsmotivs in c-Typ-Cytochromen etabliert und charakterisiert. Alle neun Dihäm-Cytochrome im Genom von G. sulfurreducens wurden untersucht, und DHC2 erwies sich als besonders geeignetes System zur Untersuchung von Häm-Packungsmotiven: Es zeigt exakt das verbreitete, parallele Packungsmotiv in einer minimalen Proteinumgebung. Gleichzeitig erschwert aber die Kleinheit des Proteins selbst die angestrebten Mutationsstudien: Bereits einzelne Punktmutationen führten in vielen Fällen zu einer Destabilisierung größerer Bereiche und resultierten entweder in unlöslichem Protein oder in ungeordneten Teilbereichen, welche einer Kristallisation im Wege standen. Die angestrebte, umfassende Punktmutagenisierung des Proteins und die Analyse der so erhaltenen Varianten konnte daher nicht im angestrebten Rahmen durchgeführt werden. Die Struktur von DHC2 selbst wurde bei einer Auflösung von 1.5 A gelöst, dabei wurde jedoch festgestellt, dass die Kristalle des Proteins pseudo-meroedrisch verzwillingt waren. Eine eingehende Untersuchung der Verzwillingung erlaubte uns im Folgenden, die Struktur mit Hilfe von SHELXL mit deutlich verbesserten Statistiken zu verfeinern. Die beobachtete Verzwillingung in P2i mit den Achsen a = c scheint eine bislang häufig übersehene, aber keineswegs seltene Beobachtung zu sein. Die 2008 publizierte Arbeit wurde bereits von zwei weiteren Publikationen zitiert, welche eine analoge Situation in humanem Neuroglobin und einer Fettsäuren-Synthetase aus Pilzen beschreiben. Es ist anzunehmen, dass eine vergleichbare Verzwillingung bei einer Anzahl der in der Protein-Datenbank hinterlegten Strukturen ebenfalls zu finden sein wird. Zudem wurde bei der Analyse von DHC2 deutlich, dass zwei ausladende, periphere Schleifen der Peptidkette an Kristal Ikon takten beteiligt waren. Hieraus entstand die Idee, durch gezielte Verkürzung dieser Bereiche eine verbesserte Kristallpackung und gleichzeitig ein verbessertes Kristallisationsverhalten von DHC2 zu erreichen, Zwei der zu diesem Zweck gefertigten Proteinvarianten erfüllten diesen Anspruch höchst überzeugend: Kristalle von DHC2 AA81 und AA81-AD82 waren nicht mehr verzwillingt, gehörten einer höhersymmetrischen Raumgruppe an und beugten Röntgenstrahlen bis zu echt atomaren Auflösungen. Sie stellen somit eine ideale Basis für weitere Studien zum Thema da, die aber im zeitlichen Rahmen des bisherigen Antrags nicht durchführbar waren. Theoretischen Arbeiten zu den Redoxeigenschaften von DHC2 wurden in Zusammenarbeit mit Prot G. M. Ullmann, Universität Bayreuth, durchgeführt. Sie zeigen bereits gute Übereinstimmung zwischen den experimentell bestimmten und den theoretisch berechneten Redoxpotentialen, und liefern gleichzeitig die Grundlage für ein weitere Optimierung der benutzten Algorithmen. Parallel zu den Arbeiten am Modellsystem DHC2 wurde Cytochrom-c-Nitritreduktase als komplexes Multihäm-Enzym untersucht, hier insbesondere die Reaktivität gegenüber dem alternativen Substrat Sulfit, sowie erstmalig strukturelle Studien an Varianten des Proteins, hergestellt in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Jörg Simon, TU Darmstadt. In weiteren Arbeiten wurde ein Teilaspekt des Reifungssystems für C-Typ-Cytochrome beleuchtet und in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prot Linda Thöny-Meyer, EMPA St Gallen, die Struktur der N-terminalen Domäne des Membranproteins CcmH aus E. coli aufgeklärt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2005) Structural and Biochemical Characterization of DHC2, a Novel Diheme Cytochrome c from Geobacter sulfurreducens. Biochemistry 44, 12411-12419
Heitmann, D. & Einsle, O.
- (2008) Binding and Reduction of Sulfite by Cytochrome c Nitrite Reductase. Biochemistry 47, 2080-2086
Lukat, P., Rudolf, M., Stach, P., Messerschmidt, A., Kroneck, P. M. H., Simon, J. & Einsle, O.
- (2008) Helix swapping leads to dimerization of the N-terminal domain of the c-type cytochrome maturation protein CcmH from Escherichia coli. FEBS Lett., 582, 2779-2786
Ahuja, U., Rozkhova, A., Glockshuber, R., Thöny-Meyer, L. & Einsle, O.
- (2008) Pseudo-merohedral twinning in crystals of the diheme c-type cytochrome DHC2 from Geobacter sulfurreducens. Acta Cryst 064, 993-999
Heitmann, D. & Einsle, O.
