Aktinobakterieller Stoffwechsel: Erforschung der Verbindungen zwischen dem hybriden PDH-ODH-Komplex, der Signalkaskade GlnH-GlnX-PknG-OdhI und dem Glutamat-Exporter MscCG

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Bott; Professor Dr. Marc Bramkamp
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 545494849

Actinomyceten bilden eine der artenreichsten Bakteriengruppen und umfassen Pathogene wie Mycobacterium tuberculosis, Antibiotika-Produzenten wie Streptomyceten und industrielle Zellfabriken wie Corynebacterium glutamicum. Angesichts ihrer großen Bedeutung in vielen wirtschaftlich und gesellschaftlich relevanten Bereichen ist ein detailliertes molekulares Verständnis der Physiologie von Actinomyceten wichtig, sowohl für therapeutische Anwendungen als auch für biotechnologische Zwecke. Der GLUTACTINO-Projektantrag basiert auf den Ergebnissen unseres DFG-ANR-Projekts METACTINO und fokussiert auf drei eng zusammenhängende spannende Themen am 2-Oxoglutarat/Glutamat-Knotenpunkt des Zentralstoffwechsels. In vorherigen Arbeiten konnten wir in C. glutamicum einen hybriden Pyruvat/2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (PDH-ODH) mit einer außergewöhnlichen Struktur und zellulären Lokalisation identifizieren. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass der PDH-ODH-Komplex jeweils ein Cluster an den Zellpolen und in größeren Zellen zusätzlich ein bis zwei Cluster in der Zellteilungsebene bildet. In Arbeitspaket 1 soll nun mittels hochauflösender Mikroskopie die Stöchiometrie und die Einzelmoleküldynamik der vier Untereinheiten OdhA, AceE, AceF und Lpd in diesen Clustern bestimmt werden sowie die Dynamik der Clusterbildung. Weiterhin soll die molekulare Ursache der Cluster-Bildung identifiziert werden. Das zweite Arbeitspaket umfasst die Analyse der von uns identifizierten Signalkaskade, welche die ODH-Aktivität und damit den Kohlenstoff-Fluss zwischen Citratzyklus und Ammonium-Assimilation durch die Glutamat-Dehydrogenase reguliert. Die Kaskade umfasst das periplasmatische Glutamat/Aspartat-Bindeprotein GlnH, den membran-integralen Transducer GlnX, die Serin/Threonin-Proteinkinase PknG und das ODH-Inhibitorprotein OdhI. OdhI bindet hochaffin an die OdhA-Untereinheit und hemmt die ODH-Aktivität. Phosphorylierung von OdhI durch PknG hebt die Bindung an OdhA auf. PknG wird in Gegenwart von Glutamat oder Aspartat im Periplasma durch GlnH und GlnX aktiviert. In Arbeitspaket 2 soll diese Signalkaskade durch Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Techniken hinsichtlich der Anzahl der Proteinkopien und der Stöchiometrie der Komponenten quantifiziert werden. Außerdem soll die Dynamik sowie subzelluläre Lokalisation bestimmt werden, um Details der Interaktionen zu verstehen. Ergänzend soll nach weiteren OdhI-Interaktionspartnern gesucht werden. Arbeitspaket 3 fokusiert auf den Glutamat-Exporter MscCG. Voruntersuchungen deuten darauf hin, dass MscCG mit der GlnH-GlnX-PknG-OdhI-Signalkaskade verknüpft ist. Die Rolle von MscCG bei der Signaltransduktion sowie die Notwendigkeit des Zusammenwirkens von OdhI und MscCG bei der Glutamat-Sekretion sollen analysiert werden. Mögliche Interaktionspartner und posttranslationale Modifikationen von MscCG sollen identifiziert sowie die zelluläre Lokalisation von MscCG und seine Struktur bestimmt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Kooperationspartner: Privatdozent Marco Bellinzoni, Ph.D.