Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von darmkrebsrelevanten Autotransporter-Adhäsinen aus Fusobacterium nucleatum

• Antragsteller: Dr. Daniel Roderer
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 548509121

Das Darmmikrobioms (IM) ist entscheidend für unsere Gesundheit. Pathologische Modulationen, d. h. Dysbiose, können Entstehung und Ausbreitung von Darmkrebs (CRC) fördern. Fusobacterium nucleatum (Fn) kommt häufig im IM von Darmkrebspatienten vor, kann die Entstehung von Tumoren initiieren und die Immunabwehr des Wirts herunterregulieren. Seine Präsenz korreliert mit Metastasierung und schlechter Prognose. Zentral für die Fn-mediierte CRC-Progression ist Fap2, ein 400 kDa großes bifunktionelles Adhäsin. Fap2 ermöglicht die Tumorbesiedlung von Fn durch Bindung an das Glykan Gal-GalNAc, seinem Krebszellrezeptor und die Deaktivierung von Killerzellen durch Bindung an TIGIT, seinem Immunzellrezeptor. Dies macht Fap2 ein primäres Ziel für die Behandlung von mikrobiell bedingtem CRC. Mechanistische Details der Fap2-Bindung von Fap2 an die Rezeptoren sind jedoch unbekannt, eine Hürde für die strukturbasierte Entwicklung von Krebsmedikamenten. Wir planen, molekulare Details der Bindung von Fap2 an beide Rezeptoren, Gal-GalNAc und TIGIT, in bisher unerreichter Auflösung und Vollständigkeit zu entschlüsseln mittels einer Kombination aus Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), Mutagenese, Protein-Protein-Interaktions-Assays, Massenspektrometrie und Kryo-Tomographie (Kryo-ET). Dazu nutzen wir unser kürzlich entwickeltes System zur rekombinanten Expression der Fap2 extrazellulären Domäne (ECD) und verkürzter Versionen. Nach deren Rezeptorbindung werden die resultierenden Komplexe durch Kryo-EM und Einzelpartikelanalyse untersucht für nahatomar aufgelöste Einblicke in die Interaktionsmechanismen (WP1.1 & 1.2). Mutagenese der Fap2/Rezeptor-Bindestellen und Interaktionssassays (Oberflächenplasmonresonanz für TIGIT und zelluläre Fluoreszenzassays für Gal-GalNAc) ergänzen die Strukturdaten (WP1.3). Für Informationen über die Verteilung von Fap2 auf der Fn-Oberfläche werden wir die Expressionsniveaus von Fap2 und anderen Adhäsinen bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen, z. B. in An- und Abwesenheit anderer Bakterien oder Immunzellen, mittels surface shaving proteomics vergleichen (WP2.1). Die Oberfläche von Fn mit starker Fap2-Expression wird mittels Kryo-ET und Subtomogramm-Mittelung analysiert, um einzelne Fap2-Moleküle in ihrem natürlichen Kontext zu visualisieren. Damit wollen wir untersuchen, ob und wie mehrere Fap2 bei koordinativer Rezeptorbindung zusammenwirken (WP2.2). Unser Antrag basiert auf fundierten Vorarbeiten, nämlich der Etablierung der Produktion von Fap2-ECD und TIGIT-ECD, der Strukturanalyse von Fap2-ECD mit Kryo-EM, Interaktionsstudien von Fap2 mit beiden Rezeptoren in vitro, der Identifizierung der Interaktionsstellen, sowie der Visualisierung von Adhäsinen auf der Fn-Oberfläche mit Kryo-ET. Hier werden wir bahnbrechende molekulare Einblicke in die Fap2-vermittelte Tumorkolonisierung und Immunumgehung von Fn liefern und den Weg für die Entwicklung von Therapeutika ebnen, die auf die zugrunde liegenden Protein-Protein-Interaktionen abzielen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortliche: Dr. Christoph Andreas Diebolder; Professorin Dr. Fan Liu; Professorin Dr. Annette Moter